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基于RPA-CRISPR/Cas12a技术的十二指肠钩虫核酸检测方法的建立和评价: 2024年; 目的基于重组酶聚合酶扩增(RPA)技术和簇状规则间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR/Cas12a)技术,建立快速、便捷、高效检测人粪样中十二指肠钩虫的方法,以及时干预、降低疾病传播风险,提高公共卫生水平。方法参考十二指肠钩虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)序列,设计并筛选RPA引物和CRISPR RNA (crRNA),优化crRNA浓度、ssDNA浓度和其他反应条件,建立RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系。以10^(5)、10^(4)、10^(3)、10^(2)、10^(1)、10^(0)、10^(-1)、10^(-2)拷贝/μl的十二指肠钩虫阳性质粒为模板,分别采用RPA法和RPA-CRISPR/Cas12a法检测最低检出限,评价该方法的敏感度。分别以十二指肠钩虫(10^(5)拷贝/μl)、美洲钩虫(20 ng/μl)、异尖线虫(30 ng/μl)、旋毛形线虫(60 ng/μl)基因组DNA为模板,采用RPA-CRISPR/Cas12a法进行检测,评价该方法的特异性。以Kato-Katz法结合半巢式PCR法结果为标准,检测42份粪样(经Kato-Katz法检测31份为钩虫阳性,11份为钩虫阴性),计算RPA-CRISPR/Cas12a法的灵敏度和特异度,Kappa值比较检测结果的一致性。结果建立了基于十二指肠钩虫cox1序列的RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系,在优化的CRISPR/Cas12a体系中,LbCasl2a核酸酶终浓度为50 nmol/L、crRNA探针终浓度为50 nmol/L、ssDNA报告分子终浓度为100 nmol/L。该检测体系的反应条件为37℃40 min。RPA的最低检出限为10^(2)拷贝/μl,RPA-CRISPR/Cas12a法的最低检出限为10拷贝/μl,后者敏感度更高,且与美洲钩虫、异尖线虫、旋毛形线虫无交叉反应。与Kato-Katz法结合半巢式PCR法比较,RPA-CRISPR/Cas12a检测的灵敏度为19/19,特异度为91.30%(21/23),一致性较好(Kappa=0.904 8)。结论该研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a荧光检测体系具备快速、灵敏、特异的检测能力,为公共卫生监测和钩虫病防控提供了可靠技术支持。; 闫书宁杨汉银蔡玉春徐斌俞铖航莫子冉卢艳杨硕辛怡郑彬; 关键词：十二指肠钩虫核酸检测

内镜诊断十二指肠钩虫病的临床价值分析: 2023年; 目的分析内镜用于诊断十二指肠钩虫病的临床价值。方法选取本院2018年1月至2022年12月收治的62例十二指肠钩虫病患者,均接受胃镜下诊治,对胃镜下表现、临床疗效进行分析。结果56例患者上腹无规律性疼痛,31例反酸嗳气,36例食后腹胀纳减,20例显著消瘦,16例恶心呕吐,7例显著黑便,15例伴肢体水肿,4例吞咽困难;10例伴轻度贫血,7例伴中度贫血,8例伴重度贫血,37例不存在显著的贫血症状。62例患者均在十二指肠降部、肠球部肠黏膜发现钩虫体,长度为0.6~1.2 cm,活体表现为暗红色、肉红色或白色,呈半透明;吸附在肠壁黏膜,表现为蛇样盘曲或者蚯蚓样蠕动;十二指肠腔内均存在充血和点样出血,肠腔内存在血性分泌物;39例患者在十二指肠降部及钩球部均存在钩虫体,23例仅在十二指肠降部发现钩虫体,1例在胃腔也可见钩虫体。全部患者经为期1~2个月时间的治疗,消化道症状显著改善,贫血症状及时纠正,均治愈出院。结论内镜检查是诊断十二指肠钩虫病非常重要的手段之一,临床检查中应重点检查十二指肠降部和球部,在患者确诊后应及时、系统和规范的治疗,以改善患者预后。; 徐意楼妙姿李伟; 关键词：内镜十二指肠钩虫病

十二指肠钩虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂的分离、表达与活性研究: 2022年; 目的分离、克隆十二指肠钩虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂AduCPI1-AduCPI4基因,在大肠埃希菌中进行表达,了解重组AduCPI1-AduCPI4对组织蛋白酶(cathepsin,cat)的抑制作用。方法根据预测的4种编码AduCPI基因序列(GenBank No JQ762416-JQ762419)设计引物,采用PCR技术从十二指肠钩虫成虫cDNA中扩增AduCPIs成熟蛋白编码基因,并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建重组原核表达载体。重组载体转入到E.coli BL21(DE3),用IPTG诱导表达融合蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化破碎菌上清中的重组融合蛋白,在纯化柱上用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣,收集穿透液获得纯化的重组目的蛋白,采用SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况,采用酶活性抑制试验检测4种重组AduCPI对catB、catL和catS的抑制作用。结果扩增并克隆获得了4种AduCPI的成熟蛋白编码基因,构建的重组表达载体转化大肠埃希菌后表达相应蛋白,经纯化获得重组AduCPI1-AduCPI4。4种AduCPI抑制catS(0.5 nmol/L)(pH 6.5或7.4)的IC_(50)在(0.60±1.13)nmol/L~(2.89±1.37)nmol/L,抑制catL(0.5 nmol/L)(pH 5.5)的IC_(50)在(0.50±1.06)nmol/L~(1.42±1.07)nmol/L,抑制catB(0.5 nmol/L)(pH 6.0或7.4)的IC_(50)在(5.24±1.03)nmol/L~(68.90±1.38)nmol/L,其中以AduCPI4对3种组织蛋白酶的抑制作用最强,而AduCPI2对catS、catB(pH7.4)的IC_(50)分别为(0.80±1.08)nmol/L和(68.90±1.38)nmol/L,抑制作用效率差异较大,AduCPI2对catS具有较好的选择性抑制作用。结论克隆表达了4种AduCPI,该4种蛋白对组织蛋白酶L和S均具有很强的抑制作用,对组织蛋白酶B的抑制作用也较强,研究结果为进一步了解AduCPIs的生物学功能及其应用奠定了基础。; 邵正邓莉崔咏诗卢晓湧张菊英卢玲玲许琴英陈传何庆丰彭礼飞; 关键词：十二指肠钩虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂原核表达组织蛋白酶

十二指肠钩虫和美洲钩虫鉴定方法研究进展被引量：3: 2019年; 钩虫是肠道寄生线虫中危害最严重的虫种,据估计2010年全世界钩虫感染人数约4亿。感染人体的钩虫主要有美洲钩虫和十二指肠钩虫,两种钩虫的虫种鉴定在钩虫病的流行病学研究、钩虫病的防治策略制定、临床用药和寄生虫教学均具有重要的指导意义。目前实验室对两种钩虫的鉴定方法主要有形态学观察、免疫学检测和分子生物学检测。本文就两种钩虫的鉴定方法研究进展作一综述。; 王旗汪天平; 关键词：十二指肠钩虫美洲钩虫

光学显微镜下鉴别十二指肠钩虫与粪类圆线虫——附2例报告被引量：1: 2019年; 目的探讨十二指肠钩虫与粪类圆线虫在光学显微镜下的鉴定要点。方法采用粪便分析仪进行样本预处理,将匀浆后的粪便混悬液滴于含生理盐水的玻片上,再滴加1滴稀释后的碘液静置5min,然后在普通光学显微镜和超高倍显微镜下进行形态学分析,根据十二指肠钩虫与粪类圆线虫的形态特征结合临床资料进行鉴定。结果十二指肠钩虫与粪类圆线虫具有各自形态学特点,在普通光学显微镜和超高倍显微镜下均可对二者进行鉴定。结论十二指肠钩虫与粪类圆线虫仍有较高的感染率,因十二指肠钩虫与粪类圆线虫形态较为相似,在光学显微镜下应注意鉴别,临床实验室应注意检验质量,以免误诊、漏诊。; 卢立江邓爽赵红英韦胜梁莉陈宗波黄华艺; 关键词：十二指肠钩虫粪类圆线虫光学显微镜

一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒: 本发明提供了一种基于RAA荧光法检测十二指肠钩虫的引物、试剂盒，属于分子生物学技术领域。所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物具有如序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；所述下游引物具有如序列表中SEQ ...; 戴洋王晓婷倪碧娴茅范贞曹俊郭利川刘燕红王智宏应清界; 文献传递

结肠肝曲十二指肠钩虫1例被引量：1: 2017年; 本文报道了1例寄生于结肠肝曲的十二指肠钩虫初期被误诊的情况,总结了钩虫的实验室检查方法,并分析了误诊原因。; 唐玉凤王凤梅温雪尚晓泓; 关键词：钩虫病直接涂片法肠镜检查

十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1的原核表达及其抗凝活性研究被引量：4: 2016年; 目的分离、克隆十二指肠钩虫抗凝肽AduNAP1基因,在大肠埃希菌中重组表达AduNAP1,并检测其抗凝活性。方法以十二指肠钩虫成虫cDNA为模板,PCR扩增AduNAP1成熟肽编码序列,并克隆、连接到表达质粒pET32a-sumo,构建原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP1。重组载体转入到大肠埃希菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达。重组产物经Ni亲和层析后用SUMO蛋白酶酶切融合伴侣,纯化获得重组目的多肽。用SDS-PAGE分析蛋白表达及纯化情况,用凝血时间法(PT及aPTT)检测重组多肽的抗凝活性。结果扩增并克隆AduNAP1成熟肽编码序列,构建的原核表达载体pET32a-sumo/AduNAP-1转化大肠埃希菌表达rAduNAP1。纯化的rAduNAP1能延长PT及aPTT,但延长PT作用更为显著,其延长2倍PT及aPTT时间所需的浓度分别约为142nmol/L及406nmol/L。结论构建rAduNAP1表达载体,其表达产物具有较强抗凝活性,为进一步了解AduNAP1的生物学功能及作为抗凝新药开发应用奠定了基础。; 陈耀哲邓莉邵正何庆丰司徒永立周叶彭礼飞; 关键词：十二指肠钩虫原核表达抗凝活性

电子胃镜诊断十二指肠钩虫病30例临床分析被引量：1: 2015年; 目的：观察钩虫卵直接涂片检查法与电子胃镜在诊断十二指肠钩虫病的临床价值。方法：对30例明确诊断的十二指肠钩虫病患者进行回顾性分析，比较钩虫卵直接涂片检查法与电子胃镜2种检查方法的诊断符合情况。结果：在30例十二指肠钩虫病患者中，采用钩虫卵直接涂片检查方法，检测出23名患者，诊断的发现率为76．67；而采取电子胃镜的方法，结果发现有28名患者被检测患有十二指肠钩虫病，诊断的发现率为93．33％。通过卡方检测，可以得出两者之间的差异有统计学意义（P=0．006）。结论：在对十二指肠钩虫病的临床诊断中，电子胃镜的优势明显大于钩虫卵直接涂片检查法，而钩虫卵直接涂片检查法更适用于对该病的确诊性诊断。; 康继厚; 关键词：十二指肠钩虫病电子胃镜

基于核糖体RNA ITS1-5.8S-ITS2基因序列的十二指肠钩虫分子系统发育分析: 2015年; 目的通过克隆十二指肠钩虫的ITS1-5.8S-ITS2,初步分析钩口属的系统发育,构建基于ITS1、ITS2的圆线目线虫的系统进化树,为进一步研究其遗传进化关系奠定基础。方法从厦门海沧东孚镇收集标本,分离,形态鉴定为十二指肠钩虫,分别克隆了供试钩虫的ITS1-5.8S-ITS2序列,经NCBI网站的BLAST比对以及基于ITS1和ITS2序列的钩口属的系统发育分析。结果供试钩虫的ITS1、5.8S和ITS2序列,它们的长度分别为366bp、153bp和221bp,登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov进行BLAST,在数据库中没有与之相匹配的序列,将获得的序列作为新的序列上传至GenBank中进行注册,各序列的GenBank登录号分别为:5.8SrRNA基因:EU344796、ITS1-5.8S-ITS2:EU344797。结论从系统进化树中,本实验的供试十二指肠钩虫均与GenBank中已公布的十二指肠钩口线虫自然聚类在一起。; 汪家旭苏成豪黄建炜叶曦李国伟; 关键词：十二指肠钩虫系统发育分析

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