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重组胰蛋白酶在原代地鼠肾细胞组织分离中的应用: 2025年; 为探究重组胰蛋白酶替代猪源性胰蛋白酶在乙型脑炎减毒活疫苗制备中的可行性,在相同的酶活力条件(总酶活力均为315200 U)下,利用猪源性胰蛋白酶、源于大肠杆菌BL21(DE3)表达系统的重组胰蛋白酶,以及源于毕赤酵母(X-33)表达系统的重组胰蛋白酶,分别消化原代地鼠肾块,各组实验均保持相同的消化温度和消化时间。结果发现,经上述3种胰酶消化后,细胞的分散效果及细胞生长状态均表现良好,且在培养第3天的细胞铺展率上,各组间并未显示出明显差异(P>0.05)。进一步在病毒培养阶段观察,3个组别病毒上清液的病毒滴度亦无明显差异(P>0.05)。结果表明,源于大肠杆菌BL21(DE3)表达系统和毕赤酵母(X-33)表达系统的重组胰蛋白酶,均可替代猪源性胰蛋白酶,用于乙型脑炎减毒活疫苗的制备。; 乔建曾帅张杨徐葛林; 关键词：乙脑疫苗

重组猪胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中的应用被引量：1: 2024年; 目的探究重组猪胰酶(recombinant porcine trypsin, RPT)代替猪源胰酶在冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产中的可能性。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,用4种不同浓度(0.05、0.10、0.15和0.20 mg/mL)的重组猪胰酶消化原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞,比较细胞总数、细胞活率以及培养6 d的细胞形态,筛选出最佳重组猪胰酶的工作浓度;对消化液A(含0.30%柠檬酸钠的0.30 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.15 mg/mL重组猪胰蛋白酶溶液)消化效果进行对比,选择合适的消化液;对P1代PHK细胞接种狂犬病病毒aG株,确定最佳病毒感染复数(multiplicity of infection, MOI);对不同胰酶消化的细胞接种狂犬病病毒aG株,并比较两者病毒滴度。结果重组猪胰酶对原代PHK细胞消化的最佳浓度为0.10 mg/mL,消化液A更适用于P1代PHK细胞的消化,细胞培养6 d后形成致密单层,胞体饱满;最佳MOI范围为0.10~0.50,且试验具有高度重复性;镜下观察细胞病变无明显变化,但是重组猪胰酶消化后的细胞比猪源胰酶脱落较少,肉眼可见病毒收获液更澄清;2种胰酶消化制备的P1代PHK细胞病毒滴度差异无统计学意义(P=0.630,P>0.05)。结论重组猪胰酶可以替代猪源胰酶用于制备冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞),为冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进奠定基础。; 肖蕾刘晓巍张志刚马树奇杨俊杰徐小明张艳李红芳; 关键词：原代地鼠肾细胞狂犬病病毒消化液疫苗制备

人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的免疫原性评价被引量：2: 2023年; 目的研究狂犬病病毒aG株生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)免疫接种后抗体动态水平,评价疫苗的免疫原性,并对企业A和企业B生产的狂犬病疫苗进行效力评价。方法采用企业A和B生产的人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)(简称狂苗)按暴露后免疫程序接种受试者,分别于免疫前、第1针免疫后3、7、14、42 d抽血并分离血清,用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)检测中和抗体滴度,比较2组受试者血清样本的抗体阳转率和抗狂犬病中和抗体滴度;并对2015年1月至2023年3月企业A和企业B申报批签发的狂苗抽检效价结果进行回顾性分析,效力检测采用《中华人民共和国药典》(简称《中国药典》)2020版(三部)人用狂犬病疫苗效价测定法。结果企业A和企业B生产的狂苗第1针免疫后7 d抗体阳转率分别为50.6%、51.5%,14、42 d阳转率均为100%,抗体阳转率差异无统计学意义(χ^(2)=0.0161,P=0.899);第1针免后7 d中和抗体几何平均滴度(geometric mean titer,GMT)分别为1.5、2.2 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.316,P=0.752);第1针免后14 d的GMT分别为5.7、8.7 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.864,P=0.388);第1针免后42 d的GMT分别为9.7、9.8 IU/mL,差异无统计学意义(t=0.092,P=0.925)。参照《中国药典》2015版附录3503和《中国药典》2020版附录3503第一法(NIH法)检测的企业A和企业B的疫苗效价几何均值分别为6.8和6.0 IU/剂,差异无统计学意义(t=1.699,P=0.094)。参照《中国药典》2020版附录3503第二法(改良NIH法)检测的企业A和企业B生产的狂苗效价均≥4.0 IU/剂。结论2家企业利用狂犬病病毒aG株在原代地鼠肾细胞上生产的狂苗均可以及时地在人体内诱导产生保护性抗体,回顾分析表明效价检测结果全部符合规定,疫苗具有良好的免疫原性。; 吴小红李加曹守春王云鹏石磊泰李玉华; 关键词：人用狂犬病疫苗快速荧光灶抑制试验疫苗免疫原性疫苗效力

细胞工厂培养原代地鼠肾细胞工艺的建立及优化被引量：1: 2022年; 目的采用40层细胞工厂(40-layer cell factory,CF40)工艺培养原代地鼠肾(primary hamster kidney,PHK)细胞,优化乙脑减毒活疫苗的生产工艺。方法用不同浓度新生牛血清培养不同接种密度PHK细胞,比较各组PHK细胞数量,确定CF40工艺的PHK细胞接种密度和新生牛血清浓度。通过对比CF40和15 L转瓶采用不同新生牛血清的PHK细胞培养情况,比较两种工艺对新生牛血清的选择性。对4个厂家CF40培养的PHK细胞数量进行单因素方差分析,判定对CF40的选择性。结果CF40工艺的最优条件为PHK细胞接种密度6.1×10^(5)ml^(-1)、新生牛血清浓度6%。CF40工艺对新生牛血清的选择性较低,能比转瓶工艺更稳定地培养更多的PHK细胞。4个厂家CF40培养的PHK细胞数量之间的差异无统计学意义(F=0.23,P>0.05),对CF40选择性低。结论采用CF40可以制备出满足乙脑减毒活疫苗生产要求的PHK细胞。; 李军刘少祥王玖强金鹏侯良玉张莹时萍林松徐冬鑫李俊明; 关键词：细胞工厂原代地鼠肾细胞细胞培养

人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)基质残余蛋白标准品的建立被引量：1: 2022年; 目的:研制用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中地鼠肾细胞蛋白质残留量检测(ELISA法)的国家标准品。方法:分两步进行协作标定和量值溯源,第一步采用Lowry法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品原液进行赋值,第二步采用ELISA法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品进行赋值。结果:数据经统计学处理结果,最终原代地鼠肾细胞蛋白质标准品量值为4.0μg·mL^(-1),95%可信限为:(4.0±0.5)μg·mL^(-1)。结论:建立了国家原代地鼠肾细胞蛋白质标准品,赋值准确可靠、科学严谨,可用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)基质残余蛋白的质量控制。; 石磊泰李加王玲刘晶晶张月兰王辉雷继军李玉华; 关键词：原代地鼠肾细胞标准品人用狂犬病疫苗

应用细胞工厂传代原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒被引量：6: 2021年; 目的应用细胞工厂建立原代地鼠肾(primary hamster kidney, PHK)细胞传代培养工艺,培养狂犬病病毒,为PHK细胞和人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的规模化放大奠定基础。方法选用SPF级地鼠,无菌取肾,经消化分散接种到细胞工厂中,在37℃下培养筛选出PHK细胞静置培养的最适细胞接种密度;在最适细胞接种密度下,从0.20%水解乳蛋白MEM培养基和改良的DMEM/F12培养基中筛选出更适宜地鼠肾细胞静置培养的培养基;同时对消化液A(含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶溶液)和消化液B(含0.30%柠檬酸钠的0.25%胰蛋白酶溶液)的消化效果进行比对,选择适宜的消化液;最后,使用最佳培养基和消化液对PHK细胞进行传代,观察细胞生长情况并分析代谢水平;对同一细胞批不同代次的单层细胞(P0代、P1代和P2代)接种狂犬病病毒aG株,进行多次收获,检测单次病毒收获液病毒滴度。结果 PHK细胞(P0代)在细胞工厂中适宜的接种密度为0.30×10^(6)~0.50×10^(6) cells/cm^(2);改良的DMEM/F12培养基和消化液B更适用于PHK细胞的培养和消化传代;在40层细胞工厂(CF40)中使用最佳培养基和消化液传代地鼠肾细胞至第4代(P4代),随着代次的增加,收获的细胞密度降低、葡萄糖消耗减少和乳酸生成下降;P0代、P1代和P2代细胞均有较佳的细胞状态和增殖能力;用P0代、P1代和P2代细胞培养狂犬病病毒,能有效收获4次,且单次病毒收获液病毒滴度结果符合要求,差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功建立了PHK细胞传代培养工艺,为PHK细胞的规模化放大,冻干人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)生产工艺的改进、变更以及产能的扩大提供了参考。; 李佳林张志刚刘晓巍肖蕾徐小明张艳李守丽于潆李红芳; 关键词：原代地鼠肾细胞细胞工厂消化液传代培养狂犬病病毒

人用狂犬病疫苗原代地鼠肾细胞蛋白质国家对照品的建立被引量：1: 2021年; 目的建立用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中地鼠肾细胞蛋白质残留量检测(ELISA法)的国家对照品。方法采用ELISA法,用原代地鼠肾细胞蛋白质标准品(量值为4.0μg/mL)对原代地鼠肾细胞蛋白质对照品进行协作标定赋值,并进行均匀性和稳定性分析。结果协作标定的数据经统计学分析后,原代地鼠肾细胞蛋白质对照品量值为34.7 ng/mL,95%参考范围为(34.7±10.1)ng/mL,该对照品的均匀性和稳定性考察也符合要求。结论建立了人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)原代地鼠肾细胞蛋白质国家对照品(批号为:250025-201901),以确保检测体系的准确、可靠。; 石磊泰李加张月兰王辉雷继军郭中平李玉华; 关键词：人用狂犬病疫苗原代地鼠肾细胞宿主蛋白国家对照品

森林脑炎灭活疫苗(地鼠肾细胞)细胞工厂培养工艺的建立被引量：2: 2021年; 目的应用细胞工厂代替转瓶,培养原代地鼠肾细胞制备森林脑炎灭活疫苗,建立连续培养多次收获工艺,以提高疫苗产量。方法采用40层细胞工厂培养地鼠肾细胞,确定最佳细胞培养条件。用森林脑炎病毒森"张"株感染细胞,连续收获病毒液,经超滤浓缩、灭活、柱层析纯化后获得疫苗原液,按照《中国药典》三部(2015版)进行相关检测。结果确定了细胞工厂制备森林脑炎灭活疫苗的工艺参数:细胞工厂最适细胞接种量为3-4对地鼠肾/层;感染病毒96 h后第1次收获,之后每48 h收获1次,可连续收获3-5次。原液中抗原含量、蛋白质含量、地鼠肾细胞蛋白质残留量、牛血清白蛋白残余量均符合《中国药典》三部(2015版)规定。结论利用细胞工厂培养原代地鼠肾细胞制备森林脑炎灭活疫苗,获得了较高的细胞密度并收获了高毒力的病毒液,可替代转瓶培养工艺大规模制备森林脑炎灭活疫苗。; 张朔赵建邹墅张颖赵东山刘晓杰刘玥翟东颖孙宏亮; 关键词：细胞工厂转瓶

人用狂犬病疫苗原代地鼠肾细胞蛋白质国家标准品的研制被引量：2: 2020年; 目的研制用于人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)中地鼠肾细胞蛋白质残留量检测(ELISA法)的国家标准品。方法分两步进行协作标定和量值溯源,第一步采用Lowry法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品原液进行赋值,第二步采用ELISA法对原代地鼠肾细胞蛋白质标准品进行赋值。随机抽取16支标准品,检测pH值,采用方差分析统计检验均匀性;将标准品分别在4、25和37℃放置不同时间(1、2、3和4周),不同时间点取3支,于-20℃保存,待所有样本放置结束后统一用ELISA法检测蛋白含量,方差分析统计检验稳定性。结果协作标定的数据经统计学分析,原代地鼠肾细胞蛋白质标准品赋值为4.0μg/mL,95%可信限为(4.0±0.5)μg/mL,均匀性及稳定性良好。结论建立了国家原代地鼠肾细胞蛋白质标准品(批号:250024-201901),赋值准确可靠、科学严谨,对人用狂犬病疫苗(地鼠肾细胞)的质量控制具有重要意义。; 石磊泰李加张月兰王辉雷继军郭中平李玉华; 关键词：狂犬病疫苗原代地鼠肾细胞宿主蛋白国家标准品

一种改良原代地鼠肾细胞传代培养方法: 本发明公开了一种改良原代地鼠肾细胞传代培养方法，选择活力旺盛且已培养成致密单层的原代地鼠肾细胞进行传代，洗去其上附着的组织块和残留血清，加入0.02% EDTA溶液，将从5~10个转瓶中收集的表层细胞合并备用；在收集表层...; 张涛戚凤春杨宇飞张瑞; 文献传递

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