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截短表达的牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白及其应用: 本发明公开了截短表达的牛病毒性腹泻病毒NS4B蛋白及其应用。将BVDV NS4B蛋白截短体表达并纯化后免疫小鼠，通过酶联免疫吸附法检测抗体效价。结果发现该截短体可实现高水平表达，并且将其免疫小鼠后可以引起小鼠产生高效价的...; 齐雪峰赵宝张颖李志军

非洲马瘟病毒VP2蛋白的截短表达及免疫原性分析: 2024年; 为评价非洲马瘟病毒(AHSV)VP2截短蛋白的免疫原性,以人工合成的含有AHSV S2的全长基因为模板,分别构建重组表达质粒p RSF-S2-502(编码1~502 aa)和p RSF-S2-1056(编码503~1056 aa),分别将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行表达。将纯化后的重组蛋白免疫小鼠后,采用间接ELISA测定小鼠血清中特异性抗体水平,用流式细胞术检测小鼠脾T细胞亚群、CD4^(+)和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平。结果显示,与PBS对照组相比,各免疫组小鼠血清中特异性抗体水平均显著升高,脾内CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞水平均显著升高;免疫组小鼠脾CD4^(+)T和CD8^(+)T细胞表达IFN-γ的水平均升高。结果表明,重组AHSV VP2截短蛋白对小鼠具有较好的免疫原性,为进一步研究VP2蛋白生物学功能及非洲马瘟病毒亚单位疫苗奠定了理论基础。; 王轩莹范亚亚户鑫兵徐婧张鸿歌田占成苟惠天郑玉姝关贵全罗建勋殷宏独军政; 关键词：非洲马瘟病毒 VP2蛋白截短表达免疫原性

猪圆环病毒3型四川株Cap蛋白的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立: 2024年; 【目的】原核截短表达猪圆环病毒3型(Porcine circovirus type 3,PCV3)四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),并建立其抗体间接ELISA检测方法,为PCV3血清学调查提供材料。【方法】以PCV3四川分离株基因组为模板,PCR扩增获得Cap蛋白编码基因片段,将其克隆至原核表达载体pET-30a(+)中构建重组质粒pET30a-PCV3-Cap。经酶切和测序鉴定后,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂亲和层析纯化,获得具有良好抗原性的重组Cap蛋白。基于纯化的重组Cap蛋白建立间接ELISA方法,确定最佳抗原包被浓度、待检血清最佳稀释比例、酶标抗体稀释比例和阴阳性临界值,对间接ELISA方法的特异性、敏感性、重复性、相关性和符合率进行分析,并对2018-2022年采自川东北地区猪场的351份临床猪血清进行检测,分析该区域PCV3流行情况。【结果】试验成功构建pET30a-PCV3-Cap重组表达载体,实现重组Cap蛋白(1-197位氨基酸)的原核截短表达,蛋白大小约为26 ku,可与PCV3阳性猪血清发生特异性反应;确定最佳抗原包被浓度为1 ng/μL,待检血清最佳稀释比例为1∶100,酶标抗体稀释比例为1∶60000,阴阳性临界值D_(450 nm)为0.684;建立的间接ELISA方法与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)和猪细小病毒1型(PPV1)阳性猪血清均不发生交叉反应,敏感度达1∶1600,批内变异系数和批间变异系数均<10%,与病毒中和试验(VNT)结果呈正相关,与Western blotting方法的阳性符合率为95.8%;2018-2022年川东北地区的351份猪血清样品阳性率为7.12%。【结论】本研究成功截短表达了PCV3四川株Cap蛋白(1-197位氨基酸),建立了特异性强、灵敏度高、重复性好和符合率高的PCV3间接ELISA方法,为PCV3的血清学调查和检测试剂盒的开发提供了材料。; 欧云文潘琴汪洋代军飞任绍科张洋翟佳佳张杰; 关键词：CAP蛋白截短表达 ELISA

牛病毒性腹泻病毒NS5B蛋白的截短表达及多克隆抗体制备: 2024年; 本研究旨在克隆牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的非结构蛋白NS5B截短基因,采用原核表达系统表达获得截短蛋白,并进一步制备其多克隆抗体。构建的原核表达质粒pET-28a-NS5B转化至BL21感受态细胞,经IPTG诱导后,发现NS5B蛋白以包涵体为主。纯化蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体具有良好的反应性,能够特异性识别真核表达的NS5B蛋白。本研究中NS5B蛋白的截短表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究NS5B蛋白的生物学功能,以及建立BVDV鉴别诊断的血清学检测方法奠定了基础。; 秦春雪夏国建何成强; 关键词：牛病毒性腹泻病毒原核表达多克隆抗体

坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)的截短表达及其抗体间接ELISA方法的建立与应用: 2024年; 为了大量表达坦布苏病毒囊膜蛋白(E蛋白)并建立一种可检测坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法,试验首先将去除跨膜域的截短坦布苏病毒E基因克隆至原核表达载体pET-28a(+)上并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达重组蛋白,利用His标签对表达的重组蛋白进行纯化;然后以重组蛋白为包被抗原、鸭待测血清为一抗、HRP标记兔抗鸭IgG为二抗,通过反应条件[抗原包被质量浓度、抗原包被条件、封闭液、封闭时间、一抗(待测血清样品)稀释液、一抗(待测血清样品)稀释度、一抗(待测血清样品)孵育条件、二抗稀释度、二抗孵育条件和显色条件]的优化和临界值的确定建立间接ELISA方法;最后进行特异性、敏感性和重复性试验,并通过临床样品检测比较该方法与Western-blot方法的符合性。结果表明:PCR扩增得到大小为1227 bp的坦布苏病毒截短E基因,经双酶切与测序验证后,成功构建重组表达质粒pET28a-E-tr。诱导后的重组蛋白分子量大小为49 ku并以包涵体的形式表达,纯化后的重组蛋白条带单一,可与鸭源坦布苏病毒阳性血清发生特异性结合。建立的ELISA方法优化后的抗原包被质量浓度为5μg/mL,抗原包被条件为4℃过夜,封闭液为2%BSA,封闭时间为60 min,一抗(待测血清样品)稀释液为1%BSA,一抗(待测血清样品)稀释度为1∶800,一抗(待测血清样品)孵育条件为37℃、30 min,二抗稀释度为1∶7500,二抗孵育条件为37℃、90 min,显色条件为37℃、10 min,阴阳临界值为0.368;仅可检测出鸭源坦布苏病毒阳性血清,无法检测出鸭源鸭疫里默氏杆菌、新城疫病毒、禽腺病毒、禽流感病毒、细小病毒阳性血清;待测血清最高稀释度为1∶3200(Western-blot方法待测血清最高稀释度仅为1∶1600);批次内重复变异系数(CV)为1.7%~4.7%,批次间重复CV为1.4%~5.7%;对137份临床鸭血清样品进行检测,阳性率为81.7%,与Western-; 唐晟马瑶冯贺龙李丽汪宏才张蓉蓉曾哲姚伦温国元邵华斌罗青平曾驰曾驰谢佳燕; 关键词：E蛋白原核表达间接ELISA 抗体

猪丁型冠状病毒NSP14蛋白截短表达及其间接ELISA抗体检测方法的建立: 2024年; 【目的】进行猪丁型冠状病毒(PDCoV)NSP14蛋白截短原核表达,制备PDCoV NSP14蛋白的多克隆抗体,并建立检测PDCoV抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA),为探究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断提供参考依据。【方法】以PDCoV 1468B毒株为模板,构建NSP14截短基因原核重组质粒pET32a-NSP14,经双酶切和测序鉴定后,通过原核表达系统获得NSP14融合蛋白,将其纯化后免疫新西兰大白兔获得NSP14蛋白的多克隆抗体,进行Western blotting验证,并用间接ELISA测定其效价。以NSP14融合蛋白为抗原包被酶标板,采用方阵滴定法优化一系列反应条件,构建检测PDCoV抗体的间接ELISA。【结果】在构建的pET32a-NSP14重组质粒中,NSP14蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体形式表达,其大小约40.2 kD;制备的NSP14蛋白多克隆抗体效价在1∶512000以上,经Western blotting验证,能与纯化的NSP14融合蛋白发生特异性反应。经过筛选,确定所构建检测PDCoV抗体间接ELISA的最佳反应条件:NSP14融合蛋白最佳包被浓度为4.0μg/mL,包被条件为37℃、2.0 h;封闭条件为5%脱脂奶粉封闭1.0 h;待检血清按1∶400稀释,孵育2.0 h;酶标二抗1∶2500稀释,孵育60.0 min;TMB底物显色时间为30.0 min。特异性试验结果表明,猪病阳性血清PRRSV、JEV、PCV2、PPV、PEDV和CSFV的OD450均小于0.235,说明优化的间接ELISA检测的病原与其他猪病毒阳性血清无反应,特异性良好。重复性试验结果表明,优化的间接ELISA检测猪病阳性血清的批内和批间变异系数均小于10.000%,说明优化的ELISA具有较好的重复性。【结论】成功制备具有高效价和良好免疫反应性的PDCoV NSP14蛋白多克隆抗体,并建立检测该抗体的特异性、敏感性和重复性良好的间接ELISA,可供进一步研究PDCoV NSP14蛋白的生物学功能及进行PDCoV监测和诊断参考应用。; 刘思雨何颖卢冰霞赵武赵硕许心婷全琛宇秦毅斌欧阳康; 关键词：多克隆抗体制备

猪流行性腹泻病毒S蛋白和M蛋白截短表达及多克隆抗体制备: 2024年; 为制备猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白和M蛋白的多克隆抗体,用蛋白结构分析软件对S和M基因序列进行分析,截取2个基因的相关抗原片段,依据大肠埃希氏菌偏好密码子进行密码子优化、序列合成。将合成的片段克隆至pET-32a(+),转化入大肠埃希氏菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测。大量表达重组蛋白,免疫昆明小鼠制备多克隆抗体。结果表明,成功表达大小约为38ku和32ku的重组蛋白Sm和Mm,免疫小鼠后制备的抗Sm多克隆抗体效价超过1:25600,抗Mm多克隆抗体效价超过1:51200,且Westernblot表明多克隆抗体特异性良好。研究制备的多克隆抗体可以为建立PEDV检测方法和开发亚单位疫苗提供材料。; 李德龙周建方余远迪丁鸿飞肖奇奇黄庄李悦林罗丽娜黄涵刘辉鑫杨婧婧付利芝; 关键词：M蛋白抗原表位多克隆抗体

血清4型禽腺病毒Fiber-1蛋白截短表达及多克隆抗体制备: 2024年; 目的:制备血清4型禽腺病毒(FAdV-4)Fiber-1基因截短蛋白多克隆抗体,为FAdV-4病的诊断、检测及致病机制研究奠定基础。方法:对FAdV-4的CH/AHMC/2015分离株Fiber-1基因序列(MG148335.1:30459-31754)进行信号肽、疏水性和抗原决定簇分析,截取具有较高免疫原性的片段,设计合成特异性引物,以CH/AHMC/2015分离株基因组DNA为模板进行PCR扩增,获得截短Fiber-1(sFiber-1)基因片段,将其连接至原核表达载体pET-32a,验证后转化至大肠杆菌BL21感受态中,诱导表达sFiber-1蛋白。纯化后的蛋白与佐剂乳化后免疫SD大鼠,制备多克隆抗体,并测定多克隆抗体效价。用Western-blot检测抗体免疫原性。结果:成功构建了sFiber-1的原核表达载体,获得FAdV-4的sFiber-1重组蛋白,经SDS-PAGE鉴定,重组sFiber-1蛋白大小约为52 kDa,主要以包涵体形式表达;间接ELISA法测得sFiber-1多克隆抗体效价为1∶2^(13);Western blot结果显示制备的多克隆抗体能特异性识别出重组sFiber-1蛋白。结论:本研究成功表达了FAdV-4的重组sFiber-1蛋白,制备了具有较高免疫活性的sFiber-1多克隆抗体,可为FAdV-4的检测及诊断奠定基础。; 罗昕雨赵磊陈玉晴缪欣怡石家鑫顾有方顾有方刘欣超; 关键词：重组蛋白多克隆抗体

FAdV-4病毒Fiber-2蛋白截短表达及其单克隆抗体和杂交瘤细胞株: 本发明公开了一种FAdV‑4病毒Fiber‑2截短蛋白，它具有序列表SEQ.ID.NO.1的氨基酸序列或由具有序列表SEQ.ID.NO.2的碱基序列的基因所编码。据此，发明人进一步制备了相应单克隆抗体，并筛选获得生长状态...; 谢芝勋韦悠李小凤阮志华谢志勤范晴张艳芳黄娇玲王盛万丽军任红玉

截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用: 本发明公开了截短表达的鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白及其应用。将鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白截短表达后通过酶联免疫吸附法评价各截短体的免疫原性。使用免疫原性更强的截短体对鳜进行注射免疫，可以显著提高鳜产生的特异性抗体水...; 王高学赵昭朱斌凌飞马瑞龚宇明

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