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苹果坏死花叶病毒CP基因原核表达及其抗血清制备: 2024年; 苹果坏死花叶病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)是近年新发现的病原物,并且是与我国苹果花叶病症状高度相关的重要病毒,进行ApNMV外壳蛋白(coat protein,CP)基因原核表达、制备多克隆抗血清,以建立快速、灵敏、准确的ApNMV常规检测方法尤为必要.通过设计特异性引物,以RT-PCR方法成功获得ApNMV CP基因序列,插入到原核表达载体pET-28a(+)中构建重组质粒,转化至大肠杆菌BL21(DE3),利用IPTG进行重组蛋白(含His-tag)诱导表达.SDS-PAGE和Western blot分析结果表明,CP基因在大肠杆菌中获得了高效表达,用Ni Sepharose 6 Fast Flow进行蛋白纯化,回收共得到重组蛋白2.4 mg.在屏障环境下免疫2只SPF级新西兰兔,制备出多克隆抗血清,稀释400倍后仍能与ApNMV阳性苹果叶片样品发生免疫反应.由此证明,本研究建立的ApNMV间接ELISA检测方法具有较好的灵敏性,检测效率高,能够用于田间大量样品ApNMV的诊断.; 邢飞王红清李世访; 关键词：外壳蛋白基因原核表达抗血清

诺如病毒P2结构域的原核表达及其抗血清制备: 2024年; 目的应用原核表达系统表达并纯化5种基因型(GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17)诺如病毒(norovirus,NV)的P2结构域,并制备其抗血清。方法利用生物信息学方法分析不同基因型NV P2序列保守性,合成P2 DNA序列,亚克隆至pET24a载体,构建重组原核表达质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达的重组P2蛋白纯化后免疫30只雌性BALB/c小鼠,制备抗血清。通过ELISA法检测抗血清的滴度和交叉反应,Western blot法检测抗血清的特异性,点杂交法分析抗血清对野生病毒的识别与结合能力。结果表达的重组P2蛋白相对分子质量约15000,纯度均达90%以上,GⅠ.1、GⅡ.2、GⅡ.3、GⅡ.4、GⅡ.17型P2蛋白表达量分别为60、26.4、19.8、16.3和33.3 mg/L。针对5种基因型NV P2抗原的抗血清滴度均达1∶128000以上,均能很好地识别自身相应的P2抗原,但不与不相关P2抗原相互作用,均不与重组人A组轮状病毒VP7抗原和重组幽门螺杆菌尿酶抗原发生交叉反应,且对野生型NV具有较好的识别与结合能力。结论利用原核表达系统成功表达并纯化了我国流行的5种基因型NV P2抗原,制备的抗血清滴度较高,特异性良好,为NV快速、现场诊断技术的建立奠定了基础。; 陈健伟李浩明雪薇王斌邓建平陆峙金杜云霄蔡璐唐秋阳李再新张智; 关键词：诺如病毒 P2蛋白原核表达抗血清

玫瑰叶畸形病毒外壳蛋白基因原核表达与抗血清制备: 2024年; 玫瑰叶畸形病毒(rosa rugosa leaf distortion virus,RrLDV)属于番茄丛矮病毒科Tombusviridae天竺葵环斑病毒属Pelarspovirus,能够引起月季叶片畸形、黄化以及提前衰老等症状,是危害月季的病毒之一。为建立玫瑰叶畸形病毒的快速检测方法,采用热硼酸盐法提取发病月季叶片总RNA,通过RT-PCR扩增该病毒外壳蛋白基因,连接至原核表达载体pDB-His-MBP上,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21以IPTG,诱导蛋白表达,获得浓度为8 mg/mL的重组蛋白,制备了兔多抗血清。Western blot检测血清效价为1∶2048000,当效价为1∶1000时,灵敏度为1∶1024。血清学检测结果与RT-PCR检测结果一致,表明该抗血清可用于RrLDV的检测,有利于检测该病毒的发生和分布。; 张秀琪聂张尧李梦林苏江月丁泽慧张宗英韩成贵王颖; 关键词：外壳蛋白原核表达抗血清制备

猪δ冠状病毒RBD的可溶性表达、纯化及小鼠抗血清制备: 2024年; 为获得猪δ冠状病毒(PDCoV)S蛋白受体结合区(RBD)的可溶性蛋白及特异性多克隆抗体血清,本研究将PDCoV流行株S蛋白(GenBank:QAA06990.1)的RBD序列添加信号肽、纯化标签与酶切位点,命名为PDCoV-RBD(简称PDR),对其进行密码子优化后合成并克隆至pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组质粒pcDNA3.1-PDR。将重组质粒转染至Expi293F细胞进行表达,并利用SDS-PAGE与Western blot进行鉴定;通过Strep-Tactin XT亲和层析纯化目的蛋白,薄层扫描分析蛋白纯度,并以纯化后的PDR蛋白免疫小鼠,制备抗PDR蛋白的特异性多克隆抗体血清,通过间接ELISA测定效价,PDCoV病毒感染细胞后,通过Western blot检测S蛋白与血清的特异性结合效果。结果显示,PDR在Expi293F细胞中获得可溶性表达,纯化得到的目的蛋白大小正确,纯度大于98%;用其免疫小鼠制备的抗血清能特异性结合病毒中天然的S蛋白。本研究获得的PDR蛋白及其小鼠抗血清可为PDCoV的诊断检测与疫苗研制提供必要的物质基础。; 崔春梅张爽张国庆张国庆高子函郝鹏飞李昌金鑫金鑫金宁一; 关键词：纯化抗血清制备

草莓轻型黄边病毒CP蛋白的原核表达及抗血清制备: 2023年; 利用PCR技术扩增草莓轻型黄边病毒(strawberry mild yellow edge virus, SMYEV)中国分离物的外壳蛋白(coat protein, CP)基因,将SMYEV CP基因克隆至原核表达载体pET-32a,重组质粒pET-cp转化大肠杆菌BL21菌株,37℃振荡培养,1 mmol·L^(-1)IPTG诱导表达,检测发现CP融合蛋白大量存在于细胞裂解上清液中。Ni^(2+)-NTA亲和树脂纯化CP融合蛋白,Western blot可检测到较单一的特异性条带,分子量约为46 kDa。用纯化的CP融合蛋白免疫家兔获得多抗血清,间接ELISA法测定抗血清效价达1∶512 000。以此多抗血清建立了Dot-ELISA和胶体金试纸条检测方法,不仅可以检测感染SMYEV的草莓样本,用于感病草莓的早期诊断和鉴定,还可以用于SMYEV CP蛋白的瞬时表达和系统表达等分析。; 卢静韩金成孙遗鑫蒋磊江彤; 关键词：外壳蛋白原核表达抗血清

李属坏死环斑病毒扬州分离物CP基因的原核表达及抗血清制备被引量：1: 2023年; 李属坏死环斑病毒(prunus necrotic ringspot virus,PNRSV)严重危害蔷薇科植物,在世界范围内普遍分布。为建立快速有效的PNRSV检测方法,依据PNRSV CP基因序列设计引物,并从桃叶片上扩增PNRSV-CP片段,将双酶切产物插入原核表达载体pET28a中,获得重组质粒pET28a-CP^(PNRSV),转化大肠埃希菌Rosetta菌株,IPTG诱导重组蛋白表达。SDS-PAGE电泳检测显示,在分子量约25 ku处有蛋白质条带,符合预期大小。镍柱亲和纯化PNRSV CP蛋白,以其纯化蛋白质免疫健康新西兰白兔,制备多克隆抗血清。Western blot、ELISA、Dot blot检测结果显示,制备的抗血清能检测到PNRSV CP基因在感病植物叶片中表达,而在健康植株中未检测到;制备的抗血清滴度稀释至1∶64000时,仍能与纯化蛋白质发生特异性反应。综上,制备的PNRSV抗血清特异性强、效价高,可用于PNRSV的快速检测。; 王智磊纪开燕赵景奎丁诗文徐小伟秦朗张坤贺振; 关键词：李属坏死环斑病毒原核表达抗血清

玉米黄花叶病毒运动蛋白的原核表达纯化与抗血清制备: 2023年; 为实现对玉米黄花叶病毒(maize yellow mosaic virus,MaYMV)的血清学检测,丰富该病毒的检测方法,将编码MaYMV运动蛋白(movement protein,MP)的基因连接到原核表达载体pDBHis-MBP上,将构建成功的原核表达质粒转化到大肠杆菌Escherichia coli中诱导表达融合蛋白,将纯化后的融合蛋白对新西兰大白兔Oryctolagus cuniculus进行免疫并制备MaYMV MP多克隆抗血清,并采用Western blot对抗血清的效价、灵敏度和特异性进行检测。结果显示,利用成功构建的原核表达载体经诱导表达获得分子量大小约为62 kD的融合蛋白,纯化后对新西兰大白兔进行免疫获得MaYMV MP抗血清,该抗血清的效价为1∶128000,灵敏度为1∶32,且该抗血清能够特异性地检测到本氏烟Nicotiana benthamiana中瞬时表达的MaYMV MP,而不与马铃薯卷叶病毒属Polerovirus及黄症病毒属Luteovirus的其他病毒发生血清学交叉反应,证明该抗血清具有良好的特异性。表明本研究制备的MaYMV MP抗血清能特异性地检测到MaYMV MP,可用于对田间样品的MaYMV血清学检测。; 马秋萌刘玉姿吴迪李洪蕊王颖韩成贵; 关键词：血清制备原核表达运动蛋白

猴痘病毒A23R蛋白的表达、纯化及其小鼠抗血清制备被引量：2: 2023年; 目的大肠杆菌细胞表达和镍柱纯化猴痘病毒(MPXV)A23R蛋白,制备小鼠抗MPXV A23R的高效价抗血清。方法构建重组质粒pET-28a-MPXV-A23R,并转化至大肠杆菌BL21中诱导表达,优化蛋白表达条件后获得大量蛋白。镍柱纯化重组蛋白A23R并进行Western blot法鉴定。纯化后的A23R蛋白免疫小鼠,制备A23R多克隆抗体,采用ELISA检测抗体免疫滴度。结果在0.6 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、诱导温度37℃、诱导20 h时,获得的A23R重组蛋白表达量最大,纯化后的蛋白纯度约为96.07%,经Western blot法鉴定为目的蛋白。重组蛋白免疫小鼠,第6周时IgG抗体的效价达到1∶102 400。结论成功获得高表达和高纯度的重组A23R蛋白,并制备了小鼠抗MPXV-A23R的高效价血清。; 王毅豪李名志贾梦乐杨领弟熊嘉琪王婷王宇刘树荣郭韫丽孔令保黎美凤; 关键词：纯化免疫

刺参AIF-1的原核表达、抗血清制备及表达: 2022年; 制备了刺参免疫相关因子AIF-1抗血清并检测AIF-1蛋白水平的表达。提取刺参呼吸树组织总RNA,利用RT-PCR技术扩增AIF-1基因编码区,大小与预期相符。PCR产物测序结果与Genebank报道序列一致。基因序列经密码子优化,体外合成并构建重组表达载体pET-29b(+)-AIF-1-his,成功诱导了可溶性重组AIF-1蛋白的表达。镍离子金属螯和层析纯化重组AIF-1蛋白,纯化产物可见单一条带。以纯化的重组AIF-1蛋白注射小鼠进行免疫,制备鼠抗AIF-1多抗血清,间接ELISA法检测抗血清效价为1∶102400。荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析结果检测到刺参内源性AIF-1蛋白的表达。灿烂弧菌体腔注射AIF-1后,刺参呼吸树和AIF-1的转录和蛋白水平表达均显著增加。; 王丽君王凤鑫王晗; 关键词：刺参抗血清荧光定量PCR 蛋白免疫印迹

甘蔗线条花叶病毒P1蛋白基因原核表达及抗血清制备被引量：2: 2022年; 甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展。建立快速有效的检测方法对于SCSMV的防控有着重要意义。本研究依据SCSMV P 1基因序列合成一对引物,扩增获得1074 bp的目的基因,将目的基因与原核表达载体pET28a连接,获得pET28a-P1^(SCSMV)。将连接正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta菌株,经IPTG诱导后,SDS-PAGE电泳检测显示在分子量约为42 kDa处有目的蛋白带,与预期的SCSMV P1大小一致。融合蛋白主要是以可溶性蛋白的形式存在。利用镍柱亲和纯化重组的SCSMV P1蛋白,并免疫健康新西兰大白兔,制备兔抗血清。Western blot分析显示,在对多个样品进行检测时制备的抗血清能特异性地识别SCSMV的P1蛋白,在受SCSMV侵染的甘蔗植株中能检测到P1蛋白的表达,而在健康植株中检测不到P1蛋白的表达。制备的抗血清稀释至1∶20000时仍能特异地检测到目的蛋白条带,说明通过大肠杆菌表达P1制备的SCSMV抗血清特异性强,效价高。本研究为SCSMV的快速检测提供了有效方法。; 徐小伟陈雯丁诗文甘海锋张坤贺振; 关键词：P1蛋白原核表达抗血清

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