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貉源阿留申病毒感染性克隆的构建及病毒拯救: 2024年; 旨在建立貉源阿留申病毒(RFAV)反向遗传系统,为在全基因水平上研究阿留申病毒的致病机制以及疫苗的研制提供平台。前期通过分段克隆成功获得RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及末端序列信息。通过无缝克隆技术将RFAV中间编码区序列M1、M2、M3及人工合成的末端编码区序列构建到表达载体pBBSmaⅠ上,测序验证获得了全长质粒pBB-RFAV,将pBB-RFAV转染至F81细胞进行病毒拯救。通过细胞病变观察、PCR检测、qPCR检测病毒相对表达量、间接免疫荧光试验(IFA)、病毒粒子电镜观察共同验证拯救病毒。结果显示,细胞在转染后第48小时即可观察到明显的细胞病变,PCR检测到RFAV片段,qPCR鉴定发现拯救病毒可在F81细胞上稳定传代,增殖动态与水貂阿留申病毒(AMDV)相似,IFA结果显示感染细胞呈现特异荧光信号,通过电镜观察发现拯救病毒的粒子形态与AMDV已知形态特征基本一致。上述结果表明,构建了RFAV全基因组感染性克隆,并成功拯救出rRFAV,为深入研究阿留申病毒的病原学和免疫学奠定了基础。; 彭倩文赵永强邵西群王桂武张傲陈立志章秀婷; 关键词：感染性克隆病毒拯救

BHV-1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用: BHV‑1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用，属于病毒遗传操作技术领域。为解决现有BHV‑1的基因编辑方法存在效率低、耗时长、重组病毒纯化困难等问题，本发明通过将BHV‑1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体...; 尹鑫汪孟航郭永琪

BHV-1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用: BHV‑1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用，属于病毒遗传操作技术领域。为解决现有BHV‑1的基因编辑方法存在效率低、耗时长、重组病毒纯化困难等问题，本发明通过将BHV‑1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体...; 尹鑫汪孟航郭永琪

基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救: 2024年; 为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。; 关飞虎王静宋亚芬温立佳田野蒋颖杨承槐张辉张乾义; 关键词：猪瘟病毒感染性克隆

阿留申病毒点突变感染性克隆的构建与病毒拯救: 彭倩文

A型塞尼卡病毒3'非编码区突变及多聚A尾删减对病毒拯救的影响: 赵地

猪盖塔病毒感染性克隆构建及病毒拯救: 2023年; 为研究盖塔病毒(GETV)致病机制,需搭建可靠的盖塔病毒(GETV)反向遗传操作平台。首先构建GETV/HuN1株的全长感染性克隆质粒,并在nsP4基因与C基因之间或E1基因与3′UTR之间插入亚基因组启动子26S和报告基因EGFP,将3个重组质粒分别转染至BHK-21细胞中,拯救病毒,鉴定重组病毒和外源基因稳定性,测定病毒滴度并绘制生长曲线。以重组质粒pACYC-177-GETV为模板进行RT-PCR扩增,结果显示,GETV每个蛋白基因均能正确扩增出相应条带。IFA鉴定结果显示,E2与6K蛋白抗体能与rGETV特异性结合。将EGFP基因分别插入到C基因的上游或E1基因的下游,产生报告病毒rGETV-EGFP/C和rGETV-EGFP/E1。在2种报告病毒感染的BHK-21细胞上均能观察到EGFP高表达,将报告基因插入E1基因下游,可保持其更高的稳定性。此外,生长曲线显示,重组病毒具有与亲代病毒相似的生长速度。综上,GETV反向遗传操作平台的成功建立为研究GETV蛋白功能和研发疫苗奠定了基础。; 周景业孟慧鹿田原牟春晓陈振海; 关键词：盖塔病毒感染性克隆病毒拯救报告基因

小反刍兽疫病毒感染性cDNA克隆的构建与病毒拯救: 2023年; 小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus,PPRV)是影响全球畜牧业的一种重要病原。本研究旨在建立稳定可靠的PPRV反向遗传操作平台,为解析PPRV致病机理、免疫逃逸机制、病毒复制机制等基础理论研究提供有效的技术平台,同时为开发更加安全、有效的新型疫苗奠定必要的前期基础。通过提取PPRV Clone9株的RNA,采用RT-PCR分6段扩增出PPRV反基因组cDNA,通过酶切、连接出PPRV Clone9株全长反基因组,获得pB-PPRV,同时构建表达PPRV核蛋白(nucleoprotein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和大蛋白(large protein,L)的3个辅助质粒。将pB-PPRV与辅助质粒通过脂质体转染BHK-T7细胞。转染3 d后,冻融3次,感染Vero细胞。传至第二代可观察到明显的细胞病变(CPE)。经间接免疫荧光、Western blot、RT-PCR和序列测定鉴定结果表明,拯救出具有感染性的病毒。拯救病毒(rPPRV-Clone9)在Vero细胞上可稳定传代,增殖动态与亲本病毒相似。本研究成功建立了PPRV Clone9株的反向遗传系统。; 王煜高月异高金源刘伟洁徐慧琳薛青红; 关键词：小反刍兽疫病毒病毒拯救

表达高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的伪狂犬病病毒拯救与纯化: 2023年; 为研制预防高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)感染的重组伪狂犬病病毒(PRV)活载体疫苗候选毒株,本研究依据HP-PRRSV HuN4毒株GP5基因序列设计并合成1对特异引物,BamHⅠ引入到引物的5′端,从HP-PRRSV毒株的RNA中,用RT-PCR扩增HP-PRRSV GP5基因。将BamHⅠ酶切的PCR产物与同样酶切并去磷酸化的PRV转移载体pG相连接,构建重组质粒pG-GP5/HP-EGFP。采用脂质体转染法将pG-GP5/HP-EGFP质粒转染已接种PRV三基因缺失毒株rPRV-gE^(-)/gI^(-)/TK^(-)的ST细胞中,经病毒空斑纯化,获得携有HP-PRRSV GP5基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因的重组伪狂犬病病毒rPRV-GP5/HP-EGFP。将重组病毒rPRV-GP5/HP-EGFP接种CRISPR/Cas9 EGFP敲除质粒转染过的ST细胞,经4轮病毒空斑纯化,最终获得无绿色荧光蛋白的重组病毒rPRV-GP5/HP。经PCR鉴定及测序,证实获得的rPRV-GP5/HP在EGFP基因上缺失了1 232 bp。经RT-PCR和间接免疫荧光试验进一步表明成功构建重组病毒rPRV-GP5/HP。; 张刘辉刘颖马晓赵友驿韩莹莹金钺陈红英; 关键词：高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因伪狂犬病病毒

嵌合型PCV1-3感染性克隆的构建及病毒拯救被引量：1: 2023年; 为了构建猪圆环病毒1型(porcine circovirus type 1,PCV1)和猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的嵌合病毒PCV1-3,并为PCV3疫苗研制奠定基础,该研究以PCV1基因组为骨架,将PCV1的ORF2基因替换为PCV3的ORF2基因,构建嵌合型猪圆环病毒(PCV1-3)DNA克隆。PCR和序列测序结果显示,成功构建出了PCV1-3感染性克隆;将感染性克隆转染PK-15细胞,并将第4代病毒进行免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)和蛋白免疫印迹(Western Blot)检测,结果显示成功拯救了重组病毒PCV1-3。对第4代病毒进行滴度测定,效价为105.13 TCID 50/mL。因此,该试验成功拯救出一种新型嵌合型病毒PCV1-3,并为进一步研究PCV3疫苗奠定了基础。; 李佳昕田瑶韩先杰杨莹王硕时建立李琛刘畅彭喆吴晓燕韩红韩红; 关键词：感染性克隆 PCV1

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