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一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法: 本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种磷酸化蛋白质的纯化和分析方法。所述分析包括：使用金属氢氧化物富集待测蛋白质得到第一富集产物；酶解消化所述第一富集产物之后，使用IVB族元素的金属氧化物富集磷酸化肽段得到第二富集产物...; 陈艳梅

磷酸化蛋白质在膜性肾病中的应用: 本发明公开了一种定量检测蛋白质EZR的T567位点的磷酸化水平的试剂在制备膜性肾病诊断试剂中的应用。申请人在研究过程中发现，EZR磷酸化位点T567的磷酸化水平在IMN组中相比于对照组都存在显著的下调，可能是随着疾病进展...; 戴勇李珊珊汤冬娥何敬全

定量磷酸化蛋白质组解析17β-雌二醇致死效应的细胞调控过程: 2024年; 17β-雌二醇(E2)是人体内一种重要的内分泌激素,在生理浓度下(0.2~1.0 nmol/L)对生殖系统、乳腺等靶器官的生长发育起着重要的调节作用。但很多研究表明,高剂量(μmol/L~mmol/L)的E2能够诱导肿瘤组织消退和细胞凋亡,其具体调控机制尚不明确。本工作聚焦于高剂量(μmol/L)的E2致死效应,首先分析了μmol/L水平的E2对HeLa细胞表型的影响,发现在1~10μmol/L下E2以浓度依赖的形式抑制HeLa细胞增殖,并诱导HeLa细胞发生死亡,其中,用5μmol/L E2处理2天后可使约74%的HeLa细胞增殖受到抑制,并引起约50%的HeLa细胞死亡。在此基础上,为了探究高剂量E2诱导细胞死亡的内在调控过程,将基于固相萃取(SPE)的固定化钛离子亲和色谱技术(Ti 4+-IMAC)与基于数据非依赖采集模式(DIA)的蛋白质组定量技术结合,用于筛选HeLa细胞内参与高剂量(μmol/L)E2致死效应调控过程的磷酸化位点。最终,在5μmol/L E2和二甲基亚砜(DMSO)处理的HeLa细胞中共鉴定到超过10000个磷酸化位点;t检验分析发现,在E2处理后,有924个磷酸化位点(对应599个蛋白质)的丰度发生了显著变化(显著性水平(p)<0.01,|log 2(倍数变化)|≥1),推测其可能参与调控E2致死效应过程。此外,有453个磷酸化位点(对应325个蛋白质)仅单独发生在E2或DMSO处理后的HeLa细胞样品中,表明这些磷酸化位点在E2处理后发生了磷酸化或去磷酸化,也可能参与E2致死效应的调控过程。分别对以上两种方式筛选的E2调控的磷酸化蛋白质进行富集分析,发现这些磷酸化蛋白质主要参与细胞分裂、核糖体/核质转运、信使核糖核酸(mRNA)加工/剪接及转录等过程,表明高剂量的E2可能通过调控核糖体及mRNA加工等过程影响蛋白质转录,进而诱导细胞发生死亡。此外,我们发现表皮生长因子受体(EGFR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白(包括MAPK1、MAPK4和MAPK14)上多个磷酸化位点的修饰水平在高; 李亚楠刘晓艳王䶮刘震叶明亮汪海林; 关键词：液相色谱-串联质谱磷酸化蛋白质组 17Β-雌二醇雌激素致死效应

磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌诊治研究中的进展被引量：1: 2024年; 三阴性乳腺癌是乳腺癌中恶性程度最高的亚型,其治疗仍以化疗为主,但容易出现耐药,且患者预后较差。随着蛋白质组学技术的发展,磷酸化蛋白质组学研究取得了长足的进步,并在肿瘤发生发展机制和诊治研究中得到了广泛的应用。同样,磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌的发生发展、靶向治疗和耐药机制研究等方面也发挥着重要作用。本文主要对目前磷酸化蛋白质组学在三阴性乳腺癌中的研究进展进行综述,旨在为基于磷酸化蛋白质组学的三阴性乳腺癌发生发展机制和诊治研究提供指导和帮助。; 史云蔚左涛徐平; 关键词：蛋白质组学磷酸化蛋白质组学三阴性乳腺癌

分枝菌酸小杆菌不同生长周期的磷酸化蛋白质定量表达比较被引量：1: 2024年; 蛋白质磷酸化修饰在结核病致病菌—结核分枝杆菌中扮演重要角色,有望成为抗结核药的新靶点。本研究以结核分枝杆菌近源菌—分枝菌酸小杆菌为研究对象,分析其在不同生长时期的磷酸化蛋白质。从分枝菌酸小杆菌对数期和平台期样品中共鉴定并定量了来自385个蛋白质的573个磷酸化肽段和816个磷酸化位点,构建了分枝菌酸小杆菌不同生长期的磷酸化蛋白质组数据集。之后定量比较了该菌在对数期和平台期显著差异表达的磷酸化蛋白质,经选择性离子检测(selected ion monitoring,SIM)验证了68个磷酸化水平上调的蛋白质,主要参与细胞增殖和蛋白质翻译等通路;69个磷酸化水平下调的蛋白质,主要参与三羧酸循环的通路。差异磷酸化蛋白质在细菌生长、增殖等重要生命活动过程显著富集,为分枝菌酸小杆菌和结核分枝杆菌蛋白质磷酸化功能的揭示提供了蛋白质组学数据支撑。; 徐丹洋高媛施佳辉姜松昊薛宇张瑶; 关键词：细胞延长细胞分裂

体外冲击波对糖尿病神经痛大鼠脊髓磷酸化蛋白质组学的影响: 2024年; 目的评价体外冲击波对糖尿病神经痛大鼠脊髓磷酸化蛋白质组学的影响。方法SPF级健康雄性SD大鼠36只,2月龄,体质量200~250 g。采用随机数字表法分为3组(n=12):对照组(C组)、糖尿病神经痛组(D组)和体外冲击波+糖尿病神经痛组(E组)。C组大鼠持续普通饲料喂养,D组和E组大鼠高糖高脂喂养8周后,腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg,注射后3、7和14 d时尾静脉随机血糖均>16.7 mmol/L,大鼠机械缩足反应阈(MWT)和热缩足潜伏期(TWL)≤85%基线值即视作大鼠糖尿病神经痛模型制备成功。E组于造模后进行体外冲击波,冲击量1000冲击/次,频率10 Hz,能量1.0 bar,1次/周,共4次。于造模前(T_(0))、造模后1、2、3和4周(T_(1-4))时测定MWT和TWL。最后一次冲击后麻醉处死大鼠取腰段脊髓组织行蛋白质组学分析,免疫组化法检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、IL-1β和TNF-α的表达。结果与C组比较,D组和E组T_(1-4)时MWT和TWL降低(P<0.05);与D组比较,E组T_(1-4)时MWT和TWL升高(P<0.05)。磷酸化蛋白质组学筛选结果,D组与C组共筛选出差异磷酸化蛋白284个,E组与C组共筛选出差异磷酸化蛋白282个,E组与D组共筛选出差异磷酸化蛋白303个,磷酸化mGluR5表达差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组化结果显示,与C组比较,D组脊髓GFAP、IL-1β和TNF-α表达上调(P<0.05);与D组比较,E组脊髓GFAP、IL-1β和TNF-α表达下调(P<0.05)。结论体外冲击波减轻大鼠糖尿病神经痛的机制与抑制星形胶质细胞激活及mGluR5过度磷酸化有关。; 张柏巍叶生丽张洁杨钛心刘云琴贺纯静; 关键词：体外冲击波疗法糖尿病神经病变脊髓蛋白质组学

磷酸化蛋白质组学联合蛋白质组学分析敲除维甲酸诱导蛋白16对人结肠癌细胞的影响: 2024年; 目的分析人结肠癌HCT116细胞敲除维甲酸诱导蛋白16(RAI16)后细胞内总蛋白及磷酸化蛋白质表达的差异,探究RAI16影响HCT116细胞蛋白质功能的可能机制及相关信号通路。方法收集并提取HCT116 KO和WT细胞蛋白,SDS-PAGE检验蛋白提取效果。利用胰蛋白酶酶解蛋白后,标记肽段并进行质谱分析。对鉴定到的差异蛋白及差异磷酸化蛋白质利用GO数据库、KEGG数据库和STRING数据库进行生物信息学分析。结果SDS-PAGE结果提示蛋白无明显降解,且实验组与对照组部分关键条带有明显差异;按Foldchange≥1.5或Foldchange≤1/1.5且P<0.05为条件进行差异蛋白的筛选,共筛选出147个上调差异蛋白和230个下调差异蛋白;并筛选到106个上调磷酸化位点和217个下调磷酸化位点。将去本底差异磷酸化位点功能GO富集分析,发现差异蛋白主要在核质、细胞核及细胞质组成,RNA、钙黏着蛋白及染色质结合,DNA修复、RNA剪接及DNA为模板转录的正调控等多个方面有显著富集趋势。KEGG富集结果显示,差异蛋白主要在核质转运、剪接体、细胞周期、细胞间紧密连接、病毒致癌作用和癌症中的微小RNA等通路具有显著富集趋势。蛋白互作网络主要以DDX17、NCL、EEF2、CDK1、SSRP1和SMARCC1为核心蛋白质。统计发现,SKP1、ORC1和BAD等两组学差异变化均上调,且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著,RBL1、RB1、CDK1、CDC6、MCM4、TFDP1、CHD4和SNW1等两组学差异变化均下调,且磷酸化差异变化比蛋白差异变化更显著。结论RAI16可能通过SKP1、ORC1、RB1和CDK1等关键蛋白质在多方面生物功能和多条信号通路中发挥作用,影响细胞周期,进而影响癌症发生发展。; 陈奕孛苗根王文丁翠玲戚中田; 关键词：结肠癌 HCT116细胞磷酸化蛋白质组学

应用于原代T细胞酪氨酸磷酸化蛋白质组的高灵敏度分析方法: 2024年; 酪氨酸磷酸化在T细胞的信号转导过程中发挥着重要的作用,然而其丰度较低,鉴定困难。生物组织样本中分离获得的原代T细胞数量较少,培养和扩增的难度较大,因而常使用永生化细胞系来研究T细胞的酪氨酸磷酸化介导的信号转导过程,这通常会导致获得与原代T细胞相差较大的结论。因此,本研究发展了一种解析原代T细胞酪氨酸磷酸化修饰信号的高灵敏度的蛋白质组学方法。首先,针对原代T细胞数量有限的问题,本研究优化了一套从小鼠脾脏中分离、活化和扩增T细胞的完整流程,第4天时T细胞数量扩增到7倍以上;其次,针对酪氨酸磷酸化修饰丰度较低、不易被质谱检测的难题,本研究利用SH2超亲体(SH2-superbinder)亲和富集和固定化钛离子亲和色谱(Ti^(4+)-IMAC)技术对抗CD3和抗CD28单克隆抗体共刺激条件下的原代T细胞多肽样品进行了酪氨酸磷酸化多肽富集,并结合纳升液相色谱-串联质谱(nanoLC-MS/MS)进行解析。最终成功从1 mg蛋白质中鉴定到282个酪氨酸磷酸化位点,其中包含T细胞受体膜蛋白CD3胞内区的免疫受体酪氨酸激活序列(ITAM)上的多个酪氨酸磷酸化位点,以及信号转导相关蛋白ZAP70、LAT、VAV1等的重要位点信息。综上,本研究发展了一套深度解析原代T细胞中的酪氨酸磷酸化修饰的高灵敏度蛋白质组学分析流程,有望应用于绘制更接近生理状态下的信号转导网络。; 梁富超柯弥田瑞军; 关键词：酪氨酸磷酸化共刺激信号转导

基于定量磷酸化蛋白质组学分析DAPK1调控帕金森病发生的作用机理: 王松豪

一种快速微量样本磷酸化蛋白质组学样本的制备方法: 本发明公开了一种快速微量样本磷酸化蛋白质组学样本的制备方法。该方法步骤如下：(一)向待测样本中加入蛋白提取液，加热煮沸；加入胰蛋白酶；将待快速酶解样本置于非接触式超声仪处理；加入蛋白酶解反应终止剂，离心，收集上清液；(二...; 王冬雪贺福初黄元轩

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