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Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤的模型构建: 2024年; 目的构建Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧,再复糖、复血清、复氧的损伤模型,探究一氧化碳释放分子3(CORM-3)对Caco-2细胞单层缺氧再复氧损伤模型的影响。方法首先,培养Caco-2细胞,于37℃、含5%CO_(2)、1%O_(2)与94%N_(2)的培养箱中缺氧,建立Caco-2细胞单层缺糖、缺血清、缺氧/复糖、复血清、复氧(H/R)模型。根据缺氧时间分4组,空白对照组(Control组)、H/R 1组(缺氧4 h、复氧4 h)、H/R 2组(缺氧8h、复氧4h)和H/R 3组(缺氧12 h、复氧4 h)。其次,溶解CORM-3药物粉末并制备无活性的CORM-3(iCORM-3),按药物浓度分6组,空白对照组(Control组)、缺氧、复氧损伤模型组(H/R组)、H/R+300μmol/L CORM-3(H/R+C1组)、H/R+400μmol/L CORM-3(H/R+C2组)、H/R+500μmol/L CORM-3(H/R+C3组)和H/R+500μmol/L iCORM-3(H/R+C4组)。主要采用Cell counting kit-8(CCK8)试剂盒检测细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态变化,测定Caco-2细胞单层渗透性。结果随着缺氧时间的延长,可观察到Caco-2细胞间连接消失,细胞皱缩从培养瓶底脱落漂浮,细胞活力下降,细胞单层通透性增大。给予CORM-3药物干预处理后,相比于未干预损伤组Caco-2细胞均有不同程度的改善,细胞活力随着药物浓度的增加而上升。结论本研究成功构建Caco-2细胞单层缺氧再复氧的损伤模型,并发现CORM-3对Caco-2细胞单层H/R损伤模型可能有保护作用。; 禹昭群王晓红; 关键词：CACO-2细胞单层

黄杞苷减轻H9c2心肌细胞的缺氧再复氧损伤: 2024年; 目的探讨黄杞苷对H9c2心肌细胞缺氧再复氧损伤的影响及作用机制。方法构建H9c2心肌细胞缺氧再复氧模型,将H9c2细胞随机分为常氧+溶剂组、常氧+黄杞苷组、缺氧再复氧+溶剂组和缺氧再复氧+黄杞苷组。实时荧光定量聚合酶链反应检测相关抗氧化酶(过氧化物歧化酶2、谷胱甘肽过氧化物酶1、过氧化氢酶)的mRNA水平;试剂盒检测超氧化物歧化酶、心肌损伤标志物、丙二醛以及胱天蛋白酶-3(caspase-3)水平;免疫组织化学染色检测细胞氧化应激水平;原位末端转移酶标记法染色检测细胞凋亡水平;Western blot检测相关蛋白核转录因子红系2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)表达水平。结果常氧+溶剂组与常氧+黄杞苷组心肌损伤标志物、氧化应激、细胞凋亡等指标及Nrf2、HO-1蛋白表达比较,无统计学差异(P>0.05);与常氧+溶剂组比较,缺氧再复氧+溶剂组心肌损伤标志物、活性氧、丙二醛、caspase-3以及细胞凋亡率明显升高,相关抗氧化酶的mRNA、超氧化物歧化酶及Nrf2、HO-1蛋白表达明显降低(P<0.05);与缺氧再复氧+溶剂组比较,缺氧再复氧+黄杞苷组心肌损伤标志物、活性氧、丙二醛、caspase-3以及细胞凋亡率明显下降,相关抗氧化酶的mRNA、超氧化物歧化酶及Nrf2、HO-1蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论黄杞苷可以减轻缺氧再复氧的H9c2心肌细胞的氧化应激损伤及细胞凋亡,可能是通过Nrf2/HO-1通路发挥作用。; 文江艳滕藤唐其柱; 关键词：缺氧再复氧氧化应激细胞凋亡

三叶青黄酮通过TLR4/NF-κB通路调控NLRP3小体激活改善大鼠心肌细胞缺氧再复氧损伤的作用及机制: 2024年; 目的探究三叶青黄酮(RTHF)对大鼠心肌细胞缺氧再复氧(H/R)损伤的作用及其可能机制。方法以大鼠心肌细胞H9C2为研究对象,分为对照组、H/R组、H/R+低浓度RTHF(L-RTHF)组(25μg/mL)、H/R+中浓度RTHF(M-RTHF)组(50μg/mL)和H/R+高浓度RTHF(H-RTHF)组(100μg/mL)。通过CCK-8法检测各组细胞活力;试剂盒检测各组细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)含量;DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平;实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)和Western blot检测各组细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、消皮素D的N端切割产物(GSDMD-N)、Toll样受体4(TLR4)、磷酸化核因子κB p65(p-NF-κB p65)、核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平。结果与对照组比较,H/R组H9C2细胞活力[(71.33±1.70)%比(100.00±2.94)%,P<0.01]、SOD水平[(15.54±0.36)U/mg prot比(34.54±0.87)U/mg prot,P<0.01]降低,ROS相对DCF强度[(3.72±0.12)比(1.00±0.10),P<0.01]和LDH水平[(387.57±9.37)U/L比(182.80±11.53)U/L,P<0.01]升高,NLRP3[(2.75±0.04)比(1.00±0.02)、(4.71±0.18)比(1.00±0.11),P<0.01]、Caspase-1[(3.02±0.11)比(1.00±0.06)、(3.33±0.09)比(1.00±0.12),P<0.01]、ASC[(3.32±0.12)比(1.00±0.09)、(5.30±0.15)比(1.00±0.10),P<0.01]、GSDMD-N[(3.69±0.14)比(1.00±0.13)、(3.23±0.08)比(1.00±0.06),P<0.01]、TLR4[(4.00±0.12)比(1.00±0.09)、(5.68±0.20)比(1.00±0.10),P<0.01]、p-NF-κB p65[(6.81±0.16)比(1.00±0.10)、(3.25±0.07)比(1.00±0.05),P<0.01]相对mRNA和蛋白水平升高;与H/R组比较,H/R+M-RTHF组和H/R+H-RTHF组的细胞活力[(77.00±2.16)%、(82.00±2.16)%比(71.33±1.70)%,P<0.05或P<0.01]、SOD水平[(23.43±1.50)U/mg prot、(28.66±1.22)U/mg prot比(15.54±0.36)U/mg prot,P<0.05或P<0.01]升高,ROS[(3.24±0.05)、(2.57±0.04)比(3.72±0.12),P<0.05或P<0.01]、LDH[(332.77±5.76)U/L、(253.36±9.43)U/L比(387.57±9.37)U/L,P<0.05或P<0.01]水平降低,NLRP3[(1.86±0.06)、(1.56±0.09)比(2; 沈盛晖叶建华吴相忠张祺箐彭鹏吕珩; 关键词：心肌细胞缺氧再复氧损伤

基于受体交联蛋白激酶3探讨马钱苷对心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用机制: 2024年; 目的基于受体交联蛋白激酶3(RIPK3)探讨马钱苷对心肌细胞缺氧/复氧损伤(H/R)的作用及机制。方法分别使用马钱苷和(或)RIPK3激动剂Necrolr 1预处理H9C2心肌细胞24 h后构建H/R模型,使用CCK-8检测心肌细胞活力,使用ELISA法检测LDH释放水平,使用药物-分子对接分析马钱苷与RIPK3的分子作用,使用Hoechst/PI荧光双染色观察凋亡和程序性坏死比率,使用Calcein AM探针检测线粒体膜通透性转换孔(mPTP)开放程度,使用Western blot检测p-RIPK3、t-RIPK3、p-MLKL、t-MLKL、Cyt-c、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3的蛋白表达水平。结果一般状态下,马钱苷预处理对心肌细胞无明显毒性用,在H/R处理后发现25μmol/L马钱苷可显著升高细胞活力并降低LDH释放水平。药物-分子对接预测马钱苷与RIPK3具有可靠的结合位点,结合力为-5.68 kcal/mol。马钱苷预处理可降低Hoechst/PI阳性率,抑制mPTP开放,并同时下调p-RIPK3、p-MLKL、Cyt-c、cleaved Caspase-9和cleaved Caspase-3等程序性坏死和细胞凋亡相关蛋白的表达水平,而马钱苷和RIPK3激动剂Necrolr 1共处理则可显著削弱马钱苷对程序性坏死和细胞凋亡的抑制作用。结论马钱苷通过抑制RIPK3的磷酸化活化以同时抑制细胞凋亡和程序性坏死的发生,从而有效减轻心肌细胞H/R损伤。; 许卫攀钟可文徐航金道群刘滴王琪; 关键词：心肌缺血再灌注损伤程序性坏死

交趾黄檀新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性研究: 2024年; 目的研究交趾黄檀Dalbergia cochinchinensis Pierre ex Laness的新黄酮类成分及其抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性。方法交趾黄檀70%乙醇提取物采用硅胶、Sephadex LH-20、反相制备HPLC进行分离纯化,根据理化性质及波谱数据鉴定所得化合物的结构。采用CCK-8法检测其对H9c2心肌细胞的活性及对H9c2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用,并分析其构效关系。结果从中分离得到12个化合物,分别鉴定为阔叶黄檀酚(1)、5-O-methyllatifolin(2)、mimosifoliol(3)、5-O-methydalbergiphenol(4)、dalbergiphenol(5)、cearoin(6)、2,4-dihydroxy-5-methoxy-benzophenone(7)、2-hydroxy-4,5-dimethoxybenzophenone(8)、melannoin(9)、2,2′,5-trihydroxy-4-methoxybenzophenone(10)、黄檀素(11)、4-甲氧基黄檀醌(12)。黄檀酚及黄檀内酯类化合物对H9c2细胞毒性较小,黄檀酚类化合物抗H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤活性较强。结论化合物8为新天然产物,化合物4、9为首次从该植物中分离得到。黄檀酚类化合物可能是抗H9c2细胞缺氧/复氧损伤的主要新黄酮类成分。; 任佳慧郑启万孟晓伟庞妍陈兰英刘荣华; 关键词：H9C2心肌细胞构效关系

延胡索乙素通过ULK1/FUNDC1通路抑制线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤被引量：5: 2024年; 该研究探讨了延胡索乙素(tetrahydropalmatine,THP)通过UNC-51样激酶1(UNC-51-like kinase 1,ULK1)/FUN14结构域蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)通路抑制线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的具体机制。该研究以H9c2心肌细胞为研究对象,构建心肌细胞H/R损伤模型。首先采用细胞活力检测试剂盒检测细胞活性、微量法检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)漏出量评估THP对H9c2心肌细胞H/R损伤的保护作用。然后采用化学荧光法检测细胞内活性氧、线粒体内活性氧、线粒体膜电位、自噬小体情况,并用萤光素法检测细胞内三磷酸腺苷(adenosine 5′-triphosphate,ATP)含量评估THP对线粒体的保护作用。进一步用免疫印记检测微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)膜型(LC3-Ⅱ)和包浆型(LC3-Ⅰ)的比值,活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved caspase-3)表达水平、ULK1表达水平及其在Ser555位点的磷酸化程度,FUNDC1表达水平及其在Ser17位点的磷酸化程度探索其具体机制。结果显示,THP有效减轻H9c2细胞H/R后线粒体损伤,THP通过降低细胞内和线粒体内活性氧水平、升高线粒体膜电位保护线粒体,进而增加细胞ATP生成、升高细胞活性、降低细胞LDH漏出,减轻H9c2细胞H/R损伤;进一步研究发现THP能够降低自噬小体生成,降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值,降低凋亡相关蛋白cleaved caspase-3表达,表明THP通过抑制自噬减轻细胞凋亡;深入研究发现THP通过降低ULK1在Ser555位点和FUNDC1在Ser17位点的磷酸化程度,抑制线粒体自噬ULK1/FUNDC1通路激活,抑制线粒体自噬发生。ULK1激动剂BL-918的应用逆向验证了THP降低ULK1和FUNDC1磷酸化的作用。综上所述,THP通过ULK1/FUNDC1通路抑制线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞H/R损伤。; 辛高杰刘子馨陈原原张会雨郭帆彭涵李磊韩笑韩笑付建华; 关键词：延胡索乙素 H9C2心肌细胞

右美托咪定经STAT3/FoxO3a信号转导通路对减轻H9C2心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用: 2024年; 目的建立大鼠心肌细胞系H9C2细胞缺氧/复氧模型,探究STAT3/FoxO3a信号转导通路在右美托咪定(Dex)保护心肌缺氧/复氧损伤中的作用。方法实验时间:2023年7月至11月,地点:香港大学深圳研究院实验室。使用对数生长期的H9C2心肌细胞进行实验,将其分为不同组别:对照组(C组)、缺氧/复氧组(H/R组,缺氧6 h/复氧12 h)、Dex预处理后缺氧/复氧组(D组),以及添加STAT3抑制剂Stattic+Dex预处理后缺氧/复氧组(S组)。通过CCK8试剂盒检测细胞活力,乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测细胞损伤,丙二醛(MDA)试剂盒检测氧化应激水平,使用蛋白免疫印迹法检测相关蛋白的表达。统计学方法采用单因素方差分析。结果H/R组H9C2细胞活力、Bcl-2和P62蛋白水平均低于C组,LDH、MDA、Bax、CC-3、LC3和Beclin-1蛋白水平均高于C组(均P<0.05)。Dex组细胞活力、P-STAT3/STAT3比值及Bcl-2、P62、FoxO3a蛋白水平均高于H/R组,LDH、MDA含量及Bax、CC-3、LC3、Beclin-1蛋白水平均低于H/R组(均P<0.05)。STAT3抑制剂可减弱Dex对心肌细胞损伤的保护作用。结论Dex预处理通过STAT3/FoxO3a信号转导通路,抑制心肌细胞的凋亡和自噬,降低氧化应激水平,减轻缺氧/复氧H9C2细胞损伤,从而减轻心肌缺血再灌注损伤。; 谭艳华江龙邹素娟侯杰王云旷昕

人参皂苷Re通过Nrf2/HO-1/PGC-1α通路调控线粒体生物发生减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤的研究: 2024年; 该文探讨了人参皂苷Re通过核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)/血红素氧合酶-1(heme oxidase-1,HO-1)/过氧化物增殖体激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)调控线粒体生物发生减轻H9c2细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的机制。将H9c2细胞缺氧培养4 h再复氧培养2 h构建心肌细胞H/R损伤模型。Re预给药干预后,首先检测细胞活性、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、细胞内活性氧(Cyto-ROS)和线粒体内活性氧(Mito-ROS)水平,评估Re通过抗氧化应激对H9c2细胞H/R损伤的保护作用。其次通过荧光探针检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,ΔΨ_(m))、线粒体膜通透性开放孔(membrane permeability open pore,mPTP)变化情况,通过免疫荧光检测TOM20表达水平,研究Re对线粒体的保护作用。进一步用免疫印迹检测caspase-3、cleaved caspase-3、Cyto C、Nrf2、HO-1、PGC-1α蛋白表达水平,探讨Re抗氧化应激保护线粒体减轻H/R损伤的具体机制。结果显示,与模型组相比,Re有效减轻H9c2细胞H/R损伤氧化应激反应,Re可显著升高细胞中SOD活性,降低MDA含量,降低Cyto-ROS和Mito-ROS水平;Re对线粒体有较好保护作用,升高ΔΨ_(m),降低mPTP开放,升高TOM20表达;进一步研究表明Re促进Nrf2、HO-1、PGC-1α蛋白表达,降低凋亡相关调节因子caspase-3向cleaved caspase-3活化、Cyto C蛋白表达。综上所述,人参皂苷Re减轻H9c2细胞H/R损伤的具体机制与通过Nrf2/HO-1/PGC-1α通路促进线粒体生物发生,进而升高线粒体数量、改善线粒体功能,增强细胞抗氧化应激能力,减轻细胞凋亡有关。; 辛高杰陈原原刘子馨胥淑娟张会雨郭帆彭涵李磊韩笑韩笑付建华; 关键词：人参皂苷RE

N‑乙酰半胱氨酸通过调节线粒体自噬减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤: 2024年; 目的探讨抗氧化剂N‑乙酰半胱氨酸(NAC)减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的可能机制及线粒体自噬在其中的作用。方法体外培养H9c2心肌细胞,按随机数字表法分为3组(每组3个复孔):对照组(NC组)、缺氧/复氧组(H/R组)、缺氧/复氧+N‑乙酰半胱氨酸组(H/R+NAC组)。NC组细胞正常培养,H/R组细胞进行缺氧4 h复氧4 h处理,H/R+NAC组细胞进行缺氧4 h复氧4 h的同时给予终浓度为1.5 mmol/L的NAC。细胞计数试剂盒(CCK‑8)检测细胞活性,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)水平,2,7‑二氯荧光素二乙酸酯(DCFH‑DA)荧光探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平,5,5′,6,6′‑四氯‑1,1′,3,3′‑四乙基苯并咪唑羰花青碘化物(JC‑1)法检测线粒体膜电位水平,免疫印迹法(Western blot)检测线粒体自噬分子蛋白P62、微管相关蛋白1轻链3Ⅱ(LC3Ⅱ)、磷酸酯酶与张力蛋白同源物诱导假定激酶1(PINK1)、帕金森病蛋白(Parkin)的蛋白水平,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果与NC组比较:H/R组细胞存活率降低(P<0.05),LDH和ROS水平升高(均P<0.05),线粒体膜电位水平和P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平降低(均P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05)。与H/R组比较:H/R+NAC组细胞存活率升高(P<0.05),LDH和ROS水平降低(均P<0.05),线粒体膜电位水平和P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平升高(均P<0.05),细胞凋亡率降低(P<0.05)。与NC组比较,H/R+NAC组细胞存活率,LDH、ROS、线粒体膜电位水平,P62、LC3Ⅱ、PINK1、Parkin蛋白水平和细胞凋亡率差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论NAC可以通过促进线粒体自噬水平从而减轻H/R对H9c2心肌细胞的损伤。; 金振帅高雷纪延炜文昕郁唐赫鹏雷少青; 关键词：H9C2心肌细胞

miR-878靶向调控Pim1促进线粒体分裂导致心肌细胞缺氧/复氧损伤: 2024年; 目的心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤是导致急性心肌梗死患者不良心血管结局的重要原因。然而,目前对MI/R损伤的分子机制仍不明确。本文旨在确定微小RNA-878(miR-878)对MI/R损伤的影响及其分子机制。方法在H9c2细胞中建立缺氧/复氧(H/R)模型。采用CCK-8法检测细胞活力。采用生化试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)含量。流式细胞术分析细胞凋亡水平。采用免疫荧光法及激光共聚焦显微镜分析线粒体形态。采用免疫荧光法检测线粒体活性氧(mtROS)水平。使用双荧光素酶报告基因实验研究miR-878与Pim1的结合位点。RNA免疫沉淀(RIP)实验验证miR-878与Pim1的结合关系。实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测基因的表达水平。结果与对照组相比,miR-878在H/R处理的H9c2细胞中表达显著升高((1.00±0.25)vs(9.70±2.63),P<0.01)。在H/R诱导的细胞中,转染miR-878抑制剂能够显著增加细胞活力((46.67±3.00)vs(74.62±4.08),P<0.0001),并降低LDH释放量((358.58±41.71)vs(179.09±15.59),P<0.0001)及细胞凋亡率((43.41±0.72)vs(27.42±4.48),P<0.01)。同时,下调miR-878表达能够显著抑制DRP1介导的线粒体过度分裂及mtROS产生((6.60±0.57)vs(4.32±0.91),P<0.0001)。机制研究显示,miR-878能够靶向结合Pim1 mRNA的3'-UTR区域并抑制Pim1的表达水平。挽救实验证明,下调Pim1表达能够显著逆转miR-878抑制剂抗H9c2细胞损伤的作用(均P<0.01),并出现线粒体过度分裂及mtROS产生增加(均P<0.05)。结论在H/R条件下,miR-878通过靶向抑制Pim1表达而促进DRP1介导的线粒体过度分裂,最终导致心肌细胞损伤。; 胡淑文张晶晶白明牛小伟

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