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抗新冠病毒木瓜样蛋白酶原核表达条件优化及多克隆抗体的制备与鉴定: 2024年; 目的:优化新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro)在大肠杆菌中的表达条件,并制备高特异性大鼠抗PLpro多克隆抗体。方法:通过优化诱导时间、诱导温度和IPTG诱导浓度,确定PLpro在大肠杆菌中的最佳表达条件,以HisTrapTM亲和层析柱分离纯化PLpro后,将其作为抗原免疫大鼠,制备抗PLpro多克隆抗体,以酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和蛋白免疫印迹实验(Western blot)测定多克隆抗体的效价、抗原特异性和灵敏性。结果:PLpro最佳诱导温度为20℃、诱导时间为10 h、IPTG浓度为0.2 mmol/L;抗PLpro多克隆抗体的效价可达1∶256000,且具有良好的抗原特异性;抗PLpro多克隆抗体对抗原的检测限可达12.5 ng,具有良好的灵敏性。结论:本研究成功地进行了PLpro在大肠杆菌中的表达条件优化及高特异性大鼠抗PLpro多克隆抗体的制备,为研究PLpro在新冠肺炎中的免疫学功能奠定了基础。; 刘志成闫干干闫浩浩刘晓丽刘晓平陈云雨; 关键词：新型冠状病毒原核表达酶联免疫吸附实验多克隆抗体

SUMO和ZPDGFβR共修饰TGF-βⅠ型受体模拟肽的融合蛋白可溶性表达条件优化: 2024年; 目的优化小分子泛素相关修饰物(Small ubiquitin-related modifier,SUMO)和血小板衍生生长因子β受体亲和肽(Platelet-derived growth factor β receptor-specific affibody,ZPDGFβR)共修饰的转化生长因子β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)Ⅰ型受体模拟肽(RIPΔ),即SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达条件。方法将含有重组质粒pET28a/SUMO-Z-RIPΔ的阳性大肠杆菌Rosetta用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiopirran galactoside,IPTG)(终浓度为0.1、0.3、0.6、1 mmol/L),在不同温度和不同时间下(37℃诱导6 h,20℃诱导16 h,16℃诱导20 h)实行诱导,利用SDS-PAGE技术检测SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达情况。结果当温度为16℃、诱导时间为20 h和IPTG浓度为0.1 mmol/L时,该重组SUMO-Z-RIPΔ的可溶性表达达到最大值,约占上清中总蛋白的16.87%。结论获得SUMO-Z-RIPΔ高可溶性表达的最优条件,为往后目的蛋白的制备和纯化打下基础。; 夏彩云刘晓慧刘海峰; 关键词：可溶性表达融合蛋白

结核分枝杆菌H37Ra株HspX蛋白的表达条件优化、纯化和鉴定被引量：1: 2023年; 以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增获得HspX基因,通过DNA无缝克隆技术将其克隆至pET28a质粒中,构建重组表达质粒pET28a-HspX。将pET28a-HspX转化至大肠埃希菌表达菌株BL21(DE3),采用不同温度、IPTG浓度和时间诱导HspX蛋白表达。使用Ni-IDA亲和层析柱纯化目的HspX蛋白,透析去除咪唑,通过Western blot检测HspX抗原特异性。最终确定表达重组蛋白HspX的最佳诱导条件为:诱导温度37℃、IPTG浓度0.2 mmol/L、诱导时间8 h。结果表明,获得了高纯度和被特异性识别的可溶性Hsp X蛋白,为未来Hsp X蛋白用于结核病诊断试剂和疫苗奠定基础。; 魏婧郑如明李康生李柏青李柏青汪洪涛; 关键词：结核分枝杆菌 HSPX 原核表达纯化

牛妊娠相关糖蛋白18重组载体构建、表达条件优化和生物信息学分析: 2023年; 为了制备牛妊娠相关糖蛋白18(boPAG18),并预测其理化性质和功能,本试验优化密码子并合成boPAG 18基因,构建pET30a-boPAG18重组质粒。以聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的蛋白质表达量为指标,优化装液量、诱导剂浓度、诱导时间和诱导温度条件,采用亲和层析法纯化boPAG18,SDS-PAGE和免疫印迹法鉴定。预测boPAG18的疏水性、信号肽、修饰位点、结构和蛋白相互作用。结果显示,经双酶切鉴定,pET30a-boPAG18重组质粒构建成功,boPAG 18基因1143 bp,表达蛋白约38 kDa。确定最佳表达条件为在OD 600 nm值为0.6,装液量为40 mL,IPTG终浓度为0.2 g/L,37℃诱导4 h。纯化的boPAG18纯度高达98%,浓度为2.63 mg/mL。该蛋白分子式为C_(1923)H_(3007)N_(519)O_(541)S_(17),分子质量为42.6 ku,等电点为9.31,亲水性平均值为-0.041,为两性蛋白,蛋白质不稳定指数为42.41,在水中不稳定;脂肪系数为88.43,有381个氨基酸;消光系数为47370 mol-1·cm-1,半衰期为30 h。boPAG18前15个氨基酸为信号肽,无跨膜区域;有糖基化修饰位点57个,磷酸化修饰位点68个,B细胞抗原表位13个,二级结构中α-螺旋占比19.42%、β-转角占比5.77%、无规则卷曲占比44.88%、延伸链占比29.92%;有7个相互作用蛋白,可能参与了母体在妊娠期的泌乳、抗菌和神经保护等调节功能。本试验为深入研究boPAG18的结构和功能提供了数据支持。; 董媛李汶柯孟桂先刘磊尹茉莉王会岩; 关键词：重组质粒生物信息学

高亲和PDGFβR多肽修饰的截短型TβRⅡ的可溶性表达条件优化: 2023年; 目的探讨高亲和血小板衍生生长因子受体(Platelet derived growth factor-β receptor, PDGFβR)多肽ZPDGFβR修饰的截短型转化生长因子β Ⅱ型受体(Truncated transforming growth factor-β receptor type Ⅱ,tTβRⅡ)的重组蛋白(Z-tTβRⅡ)最佳可溶性表达的条件。方法将含有原核表达质粒pET28/Z-tTβRⅡ的阳性大肠杆菌(Rossta/pET28-Z-tTβRⅡ)置于LB培养基中培养,接着加入不同浓度的IPTG,使其终浓度为0.2、0.4、0.6、0.8 mmo/L,应用SDS-PAGE技术分析在不同温度时间下(16℃、18 h, 20℃、20 h和37℃、6 h)重组蛋白Z-tTβRⅡ的可溶性表达。结果 Z-tTβRⅡ在16℃、18 h下,0.8 mmol/L IPTG时,诱导后全菌表达约22%和诱导后上清表达约13%;Z-tTβRⅡ在20℃、20 h下,诱导后全菌0.8 mmol/L IPTG时表达约23%,诱导后上清0.2 mmol/L IPTG时表达约14%;Z-tTβRⅡ在37℃、6 h下,0.2 mmol/L IPTG时,诱导后全菌约30%和诱导后上清约20%。结论 Z-tTβRⅡ蛋白最佳表达条件为37℃、6 h、IPTG浓度为0.2 mmo/L。; 王兵刘海峰候惠娴王春涛; 关键词：可溶性表达

豇豆血红蛋白Lb Ⅱ在大肠杆菌中的重组表达条件优化、纯化与鉴定被引量：4: 2023年; 豇豆根瘤中含有大量豆血红蛋白。该蛋白是良好的天然色素,可用于人造肉的着色,本文将携带豇豆血红蛋白Lb Ⅱ基因的质粒p ET-15b转化进入大肠杆菌BL21中表达,并对表达条件进行优化。通过查找NCBI数据库得到一条全长456 bp的豇豆血红蛋白Lb Ⅱ的序列,以p ET-15b作为表达载体,大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-R-IL作为重组工程菌进行表达,成功表达出豇豆血红蛋白Lb Ⅱ,并使用镍柱层析对蛋白进行初步纯化,同时添加抗坏血酸为抗氧化剂。以IPTG浓度、温度、时间为自变量,Lb Ⅱ表达量为因变量进行单因素实验。结果表明,在IPTG终浓度为1.0 mmol/L、诱导温度为25℃,时间为14 h时,重组豆血红蛋白Lb Ⅱ的表达量最高,经SDS-PAGE凝胶电泳和可见光光谱分析法鉴定为目的蛋白Lb Ⅱ。经响应面试验优化后,表达量可以达到7.30μg/m L。本研究为后续使用工程菌发酵生产豆血红蛋白奠定了基础。; 刘萌王聪睿刘波赵祥忠; 关键词：豇豆血红蛋白响应面优化

小鼠IL-3的原核表达条件优化及其促肥大细胞分化成熟的活性研究: 2023年; 目的:对小鼠白细胞介素3(interleukin-3,IL-3)进行原核表达条件筛选和优化,为体外肥大细胞模型的高效率构建奠定物质基础。方法:根据小鼠IL-3的核苷酸序列进行大肠杆菌偏爱密码子优化并构建至p ET-28a(+)质粒中,随后转化至大肠杆菌BL21(DE3)并筛选小鼠IL-3在该体系下表达的最佳条件,结合镍亲和层析和离子交换层析对其进行纯化,验证其促进小鼠骨髓细胞分化为肥大细胞的活性。结果:成功构建pET-28a(+)-IL-3原核表达载体,诱导出在SDS-PAGE中显示约16 kDa的蛋白条带,并通过四因素多水平参数筛选确定了最佳的诱导条件。最终纯化的小鼠IL-3与干细胞生长因子联合诱导小鼠骨髓细胞分化可成功获得表面FcεRI和CD117双阳性的肥大细胞,且具有β-己糖胺酶释放功能。结论:构建了小鼠IL-3的表达载体并筛选了最佳的原核表达条件,所纯化的小鼠IL-3能够成功用于过敏反应研究的体外肥大细胞模型构建。; 胡昊扬许志强; 关键词：白细胞介素3 肥大细胞原核表达

SUMO修饰IFNγ信号转导域偶联截短型TGF-β II型受体的融合蛋白可溶性表达条件优化被引量：1: 2023年; 目的优化小分子泛素相关修饰物(SUMO)修饰IFNγ信号转导域偶联截短型TGF-βII型受体的融合蛋白SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ可溶性表达的条件。方法将已转化重组质粒pET28a/SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ的大肠杆菌Rosetta(DE3)在不同异丙基-β-D-硫代半乳糖苷浓度(0.1、0.3、0.6和1 mmol/L IPTG)、不同诱导温度(37℃、16℃和20℃)和时间(6 h、16 h和20 h)条件下进行诱导,SDS-PAGE分析SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ的表达情况。结果在20℃、IPTG为0.6 mmol/L诱导20 h时,重组蛋白SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ可溶性表达量最高,约占上清中总蛋白的20.24%。结论获得SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ可溶性表达最佳条件,为进一步制备生物活性的蛋白和后续功能研究奠定基础。; 董溢馨王小花刘海峰; 关键词：融合蛋白可溶性表达

分散泛菌胞内脱乙酰酶在大肠杆菌中重组表达条件优化及酶学特性: 2023年; 目的对分散泛菌的胞内脱乙酰酶(PantoeadispersaN-acetylglucosaminedeacetylase,Pd-nagA)进行表达条件优化及酶学性质分析。方法本研究使用聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)技术对分散泛菌全基因组中Pd-nagA基因序列进行全长扩增,将含有Pd-nagA基因的质粒pET-28a(+)转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,同时采用单因素实验,优化诱导温度、诱导前菌体生物量、诱导时间以及乳糖类似物异丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)的浓度,采用Ni2+-次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid, NTA)进行重组酶的纯化,再对其酶学特性进行测定。结果以pET-28a(+)质粒作为表达载体,大肠杆菌BL21(DE3)成功表达了可溶形式的Pd-nagA蛋白,分子量约为40kDa。当诱导温度为28℃,诱导前菌液OD600值为1.2, IPTG浓度为0.6 mmol/L,诱导时间为20 h时, Pd-nagA蛋白得到了大量表达。通过薄层层析法分析表明Pd-nagA重组蛋白能够在体外转化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖,Pd-nagA重组蛋白能够在高盐溶液中保持一半的相对酶活性,该酶4℃储存10d的相对活性仍然保持在90%以上,具有良好的储存稳定性,催化N-乙酰氨基葡萄糖生成氨基葡萄糖反应条件简单快捷。结论本研究成功异源表达了具有催化活性的Pd-nagA酶,并对表达条件进行优化及酶学特性探究,可为工业上单酶催化制备氨基葡萄糖提供一定的理论参考。; 杨文韬庞立田红陈晓易有金夏菠; 关键词：酶学特性

超敏蛋白原核表达条件优化及对葡萄生长与抗霜霉病的影响: 李梦萍

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