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短短芽孢杆菌X23中edeB基因的克隆、原核表达及转录时相分析被引量：1: 2023年; 短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)X23可产生非核糖体肽类抗生素伊短菌素,已被广泛用于植物病害的生物防治。伊短菌素合成基因簇中,edeB基因参与调控伊短菌素的合成积累。本研究利用基因同源重组技术,以edeB基因作为外源基因的重组片段,构建了原核表达载体pET28a-edeB,转化至大肠杆菌BL21(DE)中进行诱导表达;通过转录组测序检测edeB基因在短短芽孢杆菌不同培养时间(12、18、24、30和36 h)的转录时相。结果表明:edeB基因全长为771 bp,编码256个氨基酸。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,在分子质量为30 kD处有一条特异条带,与生物信息学预测的EdeB蛋白的大小一致,且EdeB蛋白主要以包涵体的形式存在。转录时相分析结果表明,edeB基因在各个培养时间点均有表达,表达模式为先升高后降低,且在30 h时表达水平最高。这些结果为进一步研究edeB基因调控伊短菌素合成积累的分子机制奠定了基础,为短短芽孢杆菌高产伊短菌素菌株的构建提供了理论依据。; 杜杰蔡海林黄彬彬黄军张翠央龙青山张亮陈海荣唐冰璇陈武刘清术; 关键词：原核表达转录时相转录组

鳗鲡疱疹病毒ORF115基因克隆、转录时相分析及原核表达: 2023年; 【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF115基因,获得ORF115基因序列生物信息学特征,分析其在病毒入侵细胞过程中的转录时相并进行原核表达,为解析ORF115基因的特性和功能及开发免疫学诊断技术和亚单位疫苗打下基础。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的基因序列,设计特异性引物扩增ORF115基因,从分离的AngHV-FJ福建株(AngHV-FJ)基因组中扩增出ORF115基因,克隆至pMD19-T载体,经酶切鉴定和测序验证,获得ORF115基因序列。采用Softberry、ProtParam、TMHMM、SignalP 5.0、PSORTⅡ及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;采用反转录PCR(RT-PCR)对ORF115基因进行转录时相分析;将ORF115基因克隆至表达载体p ET-32a,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定。【结果】克隆获得的AngHV-FJ ORF115基因全长318 bp,与GenBank已发布的参考序列相似性为100%;生物信息学预测表明,AngHV-FJ ORF115基因编码蛋白的分子量为11.8 kD,理论等电点(p I)为6.04,不稳定系数为16.38,总平均亲水性指数为0.172,属酸性弱疏水蛋白,较稳定;OR115蛋白存在跨膜结构,无信号肽,主要分布于细胞质中,有长片段抗原表位;转录时相分析结果表明,ORF115基因的转录本在病毒感染细胞后6 h即可检出,于感染24 h达峰值,随后无明显变化,属于病毒晚期基因。SDS-PAGE及Western blotting分析结果显示,ORF115基因可在大肠杆菌中表达,表达蛋白大小与预期一致,约32 kD。【结论】AngHV ORF115基因属于病毒晚期基因,其编码蛋白属酸性弱疏水蛋白,有长片段抗原表位,可能在病毒感染晚期发挥作用。获得的ORF115原核表达蛋白可用于制备多克隆抗体及AngHV亚单位疫苗开发。; 陈曦杨金先陈华陈强葛均青; 关键词：转录时相原核表达晚期基因

鳗鲡疱疹病毒ORF8基因的克隆表达及转录时相分析被引量：1: 2021年; 为研究鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF8基因的特性,根据GenBank中AngHV参考株(NC_013668)的ORF8序列设计引物,采取PCR方法从分离的AngHV福建病毒株(AngHV-FJ)基因组中扩增出特异性片段,克隆至pMD19-T载体,经酶切和测序验证,获得了ORF8的基因序列。结果表明:经生物信息学分析,ORF8编码的蛋白稳定性较好,存在跨膜结构且抗原表位多,符合病毒囊膜蛋白的特征;经转录时相分析,ORF8是病毒的早期基因(early gene,E),可能在病毒感染的早期阶段就发挥作用;将ORF8克隆至表达载体pET-32a,转化入大肠杆菌E.coli BL21中,以IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot检验,实现了ORF8在大肠杆菌中的高效表达,进一步通过割胶的方法获得了相对分子质量约为44000的高纯度融合表达蛋白。本研究为下一步评价该表达蛋白的免疫效果和制备抗体,以及开发免疫诊断试剂和疫苗提供了研究基础。; 陈曦李英英陈强宋铁英葛均青; 关键词：转录时相克隆原核表达

猪细小病毒感染PK-15细胞后TLRs转录时相的变化被引量：3: 2017年; 研究猪细小病毒(Porcine Parvovirus,PPV)感染猪肾传代细胞(PK-15 cells)后Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)表达水平变化情况,为探明PPV感染机制提供理论基础。试验利用荧光定量PCR方法检测PPV感染PK-15细胞后TLR1-10的转录时相变化。结果显示,PPV感染PK-15细胞后,TLR1在PPV感染后3h表达上调,约为对照组细胞的3.1倍,其他时段均低于正常水平;TLR3和TLR7 mRNA表达水平在病毒感染早期均低于正常水平;TLR4和TLR8的mRNA含量均在感染后3、12、36 h表达上调,TLR10分别在在3h和36 h表达上调,其他时段均不同程度的降低;而TLR2和TLR9 mRNA表达水平在感染后24 h开始升高,并于48 h达到峰值,分别为对照水平的10.1倍和26.7倍。研究表明,PPV感染PK-15细胞后能够诱导细胞上TLR2和TLR9在mRNA水平显著上调,PPV感染可能通过TLR2和TLR9受体介导感染。; 周雍靳晓慧李炳晓景亚星韩丽张利卫魏战勇; 关键词：猪细小病毒 TOLL样受体 PK-15细胞转录时相

日本乙型脑炎病毒对猪外周血单核细胞炎性因子mRNA转录时相影响的研究: 2016年; 为分析猪日本乙型脑炎病毒(JEV)感染猪外周血单核细胞后对其促炎因子转录的影响,探讨JEV感染的分子免疫致病机制。采用real-time RT-PCR方法,测定并分析了JEV感染猪外周血单核细胞(PBMC)后病毒RNA含量及白细胞介素(IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-17、IL-18)炎性细胞因子mRNA转录时相的变化。结果显示,JEV感染猪PBMC后引起IL-8,IL-12p35和p40的分泌呈现不规则的曲线,IL-18表达量持续升高;IL-17表达量持续下降,仅在感染后48 h的时候达到峰值。以上结果表明,JEV感染PBMC可促使炎性因子分泌增加,参与细胞免疫应答。; 何潇湘景亚星靳晓慧兰培英张利卫周雍魏战勇; 关键词：日本乙型脑炎病毒炎性细胞因子转录时相

痤疮丙酸杆菌对IPEC-J2细胞生长及细胞因子转录时相影响的研究被引量：1: 2015年; 目的探讨痤疮丙酸杆菌对猪空肠上皮细胞IPEC-J2生长及细胞因子转录时相的影响。方法通过显微镜观察细胞形态变化;台盼蓝拒染检测细胞存活率;实时荧光定量PCR检测IL-8、IL-10、IL-12和ZO-1基因表达量的变化。结果高浓度痤疮丙酸杆菌与IPEC-J2细胞共培养后细胞形态发生改变,活细胞数量明显减少;荧光定量PCR检测表明,痤疮丙酸杆菌能明显上调IL-8和IL-12基因的表达,明显下调ZO-1基因的表达。IL-10基因在IPEC-J2细胞中不表达。结论痤疮丙酸杆菌在体外可引起IPEC-J2细胞炎性分子分泌增加,紧密连接功能的下降。; 赵茗毅董宇航李明红李锦松孟民杰; 关键词：痤疮丙酸杆菌转录时相

PCV2与PPV共感染猪PBMCs对其白细胞介素转录时相影响: 2015年; 为分析PCV2与PPV体外共感染对猪外周血单个核细胞(PBMC)对其白细胞介素mRNA转录水平的影响,探讨PCV2与PPV体外混合感染的致病机制。运用荧光定量PCR技术,测定和分析了PCV2和PPV感染PBMC后PCV2,PPV的病毒核酸含量及IL-1β,IL-6,IL-8,IL-12p35,IL-12p40,IL-13,IL-17,IL-18等的转录时相变化。结果表明,PCV2,PPV能够感染PBMC细胞,PCV2/PPV共感染中PCV2,PPV的含量分别在24 h显著最高(P<0.01);PCV2,PPV单独感染和PCV2与PPV共感染PBMC后引起IL-1β,IL-6,IL-8,IL-17转录水平上升,IL12p35,IL-12p40,IL-18转录水平明显受到抑制。由PCV2,PPV共感染而引起的免疫反应和免疫抑制比单独感染更明显。; 景亚星张睿智何潇湘兰培英曹贝贝靳晓慧徐卫松魏战勇; 关键词：猪细小病毒共感染白细胞介素

猪核转录因子C-Rel亚基的克隆及PRV体外感染PK-15细胞对C-Rel转录时相的影响被引量：3: 2014年; 核转录因子κB是普遍存在于真核细胞中的转录调节因子,其信号通路在细菌、病毒感染宿主致病过程中起关键作用,直接调控宿主先天性免疫反应及细胞增殖、分化和凋亡,它的异常活化可能是PRV感染导致免疫抑制的重要原因。为进一步了解NF-κB C-Rel亚基序列特征及PRV对C-Rel mRNA转录时相的影响,本试验采用RT-PCR从猪外周血淋巴细胞中扩增NF-κB C-Rel ORF,获得阳性质粒后测序,进行相关生物信息学分析;运用实时荧光定量PCR技术对PRV感染PK-15细胞后不同时期C-Rel mRNA的转录水平进行定量分析。序列分析结果表明:所扩增猪C-Rel亚基ORF长1 773bp,编码590aa;猪C-Rel核苷酸序列与不同动物的C-Rel核苷酸序列相似性较高;大部分位于细胞核内(76.0%),无信号肽及跨膜区。荧光定量结果表明:与对照组相比,感染后0~4h,C-Rel转录水平下调,2和4h差异显著(P<0.05);4~12h,快速上调,12h达到转录高峰(P<0.01);12h后逐渐下降,24~120h,维持在较低水平,其中36h差异极显著(P<0.01),48、72和120h差异显著(P<0.05)。本研究推断PRV感染早期较弱的先天性免疫应答可能与C-Rel活化水平低下有关。; 付梦瑾朱玲周远成杨文宇李新琼徐志文; 关键词：C-REL 转录时相

猪流感病毒毒株感染对猪外周血淋巴细胞炎性因子转录时相的影响被引量：1: 2014年; 试验用猪流感病毒（Swine influenza virus，SIV）（毒株）体外感染猪外周血淋巴细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC），利用real—timePCR方法对病毒感染不同时间细胞中的病毒量和炎性细胞因子mRNA表达量进行检测。结果显示，感染后1h就可检测到病毒，但病毒量相对较小；在24h时病毒开始大量增殖；在72h病毒量达到最高峰，为1h时20倍以上。IL-1βmRNA的表达量在48h增加到最高；IL-6mRNA的表达量在感染后1h内显著增加；IL-8mRNA的表达量在12h时达到最大量；IL-12P35mRNA的表达量在72h迅速上升，为对照的56．1倍；IL-12P40mRNA的表达量在1～2h表达量较高；IL-13在72h达到最大值，为对照的30．7倍；IL-17mR—NA的表达量在72h达到最大值，为对照的4．9倍；IL-18mRNA的表达量在12h达到对照的1．9倍。结果表明，SIV感染PBMC后，随着病毒的大量复制，多种炎性细胞因子表达量显著增加。; 张云张龙现王亚宾李金磊陈雅君崔保安胡慧; 关键词：猪流感病毒转录时相

鸭瘟病毒UL21基因的克隆表达与转录时相分析: 本研究主要对鸭瘟病毒(DPV)CHv株UL21基因(Genbank登录号：EU195090)进行了生物信息学分析、全基因的克隆表达、蛋白纯化、多克隆抗体制备、实时荧光定量反转录PCR法分析基因转录时相,主要成果如下1鸭瘟...; 石勇; 关键词：鸭瘟病毒原核表达抗体制备转录时相; 文献传递

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