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人星状病毒非结构蛋白基因nsP1a/1真核表达载体构建及其在293T细胞中的表达: 2015年; 目的将人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因连接到真核表达载体上,转染人胚肾上皮细胞48 h后检测其表达。方法设计特异性引物PCR扩增人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1片段,分别插入真核表达载体pc DNA3.1(+)和p EGFP-N2载体,构建重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1。在转染试剂PEI的介导下将重组表达质粒分别转染293T细胞,转染48 h后分别在荧光显微镜下观察EGFP的表达以及通过Western blot检测ns P1a/1基因的表达。结果重组表达质粒pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His和p EGFP-N2-ns P1a/1构建成功;转染p EGFP-N2-ns P1a/1后48 h能够在荧光显微镜蓝色激发光下观察到较强的黄绿色荧光;转染pc DNA3.1(+)-ns P1a/1-His后48 h收集细胞进行Western blot检测,能够检测到ns P1a/1-His融合报告基因的表达。结论成功构建了人星状病毒非结构蛋白ns P1a/1基因真核表达质粒,并在人胚肾上皮细胞293T细胞获得表达,为进一步深入研究ns P1a/1在人星状病毒抵御宿主细胞抗病毒天然免疫中是否发挥作用奠定了基础。; 毕艳红崔成成黄芬井申荣; 关键词：293T细胞

番鸭呼肠孤病毒σNS非结构蛋白基因的表达及其多克隆抗体的制备: 番鸭呼肠孤病毒(MDRV)主要侵害4～45日龄的番鸭,死亡率很高,临床上以软脚,腹泻等为主要症状,以肝、脾肿大及灰白色坏死点等为主要病变,耐过番鸭常出现明显的生长停滞。该病能够引发免疫机能抑制,削弱机体免疫力,很容易继发...; 朱二鹏; 关键词：番鸭呼肠孤病毒原核表达真核表达多克隆抗体; 文献传递

猪流感病毒H1N1亚型天津分离株核蛋白、基质蛋白、非结构蛋白基因克隆与序列分析: 2014年; 从天津地区不同猪场分离到6株H1N1亚型猪源流感病毒(SIV)。根据GenBank发表的H1N1亚型SIV的核蛋白(NP)、基质蛋白(M)及非结构蛋白(NS)基因序列,分别设计3对引物,将RT-PCR产物克隆至pMD18-T载体,进行测序分析。遗传进化分析结果表明:A/swine/Tianjin/TJ2/2005(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ4/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Guangdong/33/2006(H1N1)位于同一分支上,属于古典型H1N1猪谱系;A/swine/Tianjin/TJ3/2006(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ8/2006(H1N1)的NP、M及NS基因核苷酸在遗传进化树中均与A/Dunedin/2/2000(H1N1)组成一个大分支,可能起源于人谱系;A/swine/Tianjin/TJ6/2009(H1N1)与A/swine/Tianjin/TJ7/2009(H1N1)NP、M及NS基因核苷酸序列在遗传进化树中均与A/swine/Jiangsu/s15/2011(H1N1)位于同一分支上,属于类禽H1N1猪谱系。本试验对6株H1N1亚型SIV的NP、M及NS全基因序列进行分析,在一定程度上揭示了天津地区H1N1亚型SIV的基因进化与流行情况。; 孙英峰鄢明华路超李秀丽张莉韩伟任卫科田向学; 关键词：猪流感核蛋白基因非结构蛋白基因

猫细小病毒非结构蛋白基因克隆及抗原表位预测: 2014年; 为了对猫细小病毒非结构蛋白基因进行克隆，试验根据猫细小病毒（CU-4）基因序列设计了1对引物，采用PCR方法对NS基因进行了扩增，将扩增产物纯化后克隆入pMD18-T载体，并应用DNAStar软件预测NS蛋白抗原表位。结果表明：NS基因的序列长度为2007bp，编码．668个氨基酸，厥段121～126aa？243～247aa、256—260aa、388—393aa、467～477aa、498～505aa、559—563aa、589—593aa和624—628aa等区域可能是线性表位优势区域。; 黎明闫冰李胜于天飞; 关键词：猫细小病毒非结构蛋白基因克隆表位预测

福建省禽流感病毒非结构蛋白基因特征分析: 2014年; 目的明确福建省不同亚型不同源的禽流感病毒非结构蛋白基因（non-structural gene，NS）的遗传进化关系及氨基酸变异特征。方法将2011年分离的毒株A／Chicken／Fujian／FZ04／2011（H9N2）（FZ-04株）、A／Chicken／Fujian／FZll／2011（H9N2）（FZ-11株）的Ns基因，与GenBank上登录的1997-2011年福建省不同源不同亚型的AIV毒株及国内外代表株的NS基因进行序列比对和遗传进化分析。结果FZ-04和FZ-11株与福建省AIV的NS基因同源性分别为88．2％～99．0％，88．3～99．4％。福建省H5N1亚型毒株均属于Y439亚群，H9N2亚型毒株均属于Y280亚群。福建仅H5N1毒株的NS1蛋白80～84位有5个氨基酸缺失，且在羧基末端存在ESEV／GsEV两种PL基序，这可能是福建省区分高致病性和低致病性禽流感病毒的标志之一。结论NS基因的特征分析表明，福建省H9N2毒株没有向高致病性H5N1毒株突变的嗜性，为今后进一步分析福建省禽流感病毒的NS基因遗传进化关系及毒力变异提供科学依据。; 朱春华林甦陈珍刘斌琼万春和傅光华黄瑜; 关键词：禽流感 NS基因进化分析

番鸭细小病毒ZQ分离株非结构蛋白基因的克隆及序列分析被引量：4: 2013年; 为了解番鸭细小病毒（MDPV）ZQ株非结构蛋白（NS）基因的分子生物学特性,根据已发表的MDPV基因组分别设计并合成了扩增NS1和NS2基因的特异性引物,应用PCR从MDPV阳性病料中扩增出NS1和NS2基因片段,将其分别连接到pMD 18-T载体上,通过双酶切和PCR筛选出阳性重组质粒。序列分析结果表明,克隆的NS1片段全长1 884bp,编码627个氨基酸,NS2片段全长为1 356bp,编码451个氨基酸。NS1与国内外已发表过的病毒株的核苷酸序列的同源性为98.1%-99.6%,NS2核苷酸序列的同源性为98.2%-100%。系统进化树分析表明,该分离株与福建和广东株亲缘关系最近。; 王文秀张松林付强沈志强; 关键词：番鸭细小病毒 NS1基因 NS2基因

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析被引量：1: 2012年; 目的探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hoch)i、3株动物RV(EW、OSU、SAl)l和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hoch)i和3株动物RV(EW、OSU、SAl)l同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右;(2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.; 刘梅杨娟赵亚玲侯宗柳戚勤周丽芳黄永坤; 关键词：轮状病毒 NSP4 基因

基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成中多位点缺失突变的校正方法: 2011年; 目的:建立一种PCR方法,以快速校正基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的多位点缺失突变。方法:用PCR方法合成基孔肯雅病毒非结构蛋白基因;对测序的克隆进行序列比对,分析不同克隆上缺失突变发生的位置,以保守区域互相重叠的寡核苷酸为上下游引物、以该区域测序正确的克隆为模板进行PCR扩增,得到所需片段,再将这些片段用PCR方法进一步组装成完整的基因序列并进行测序。结果:测序结果表明,经过2次PCR扩增,校正了基孔肯雅病毒非结构蛋白基因合成过程中发生的5个位点缺失突变。结论:得到序列正确的基孔肯雅病毒非结构蛋白基因。在进行基因合成过程中如发生多位点缺失突变,可利用该方法同时对以上突变进行校正,无须再合成引物,降低了实验操作难度,并提高了实验效率。; 范华昊王娟安小平王晓娜李建彬陈斌李存米志强童贻刚; 关键词：基孔肯雅病毒非结构蛋白基因基因合成

H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因NS1的表达及其单克隆抗体的研制被引量：2: 2011年; 利用RT-PCR技术扩增获得了H9N2亚型禽流感病毒的NS1基因,ORF长度为654bp。成功构建了重组表达载体pET-NS1,将其转化BL21,并诱导表达出了相对分子质量大约为28 000的NS1融合蛋白。NS1融合蛋白经His trap Hp Kit柱子纯化,采用缓慢稀释和透析相结合的方法复性H9N2-NS1蛋白,获得纯度较高的NS1蛋白,以纯化的NS1免疫BALB/c小鼠,间接接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗H9N2-NS1单克隆抗体(McAbs)进行特异性分析;建立了2株稳定分泌抗H9N2-NS1McAbs的杂交瘤细胞系6B9和6C2;腹水的特异性鉴定结果表明,2株McAbs能特异性的识别H9N2-NS1,而与H5N2亚型AIV、H9N2亚型AIV、NDV、IBV、IBDV、ILTV、EDS76均不发生反应。Western blotting鉴定表明,所获得的单抗只与NSl蛋白条带反应。亚类显示,6B9为IgG1,6C2为IgG2b。结果表明,2株抗H9N2-NS1McAbs的制备对H9N2亚型禽流感病毒检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。另外,NSl蛋白单抗的成功研制为进一步研究NSl蛋白的结构、功能与细胞的相互作用机制及AI遗传变异规律奠定了一定的基础。; 杨霞陈少渠李建丽王川庆王泽霖; 关键词：H9N2亚型 NS1基因单克隆抗体

猪繁殖与呼吸综合征病毒GS株非结构蛋白基因的克隆及测序: 2011年; 根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)VR-2332毒株基因序列设计合成了9对引物,采用RT-PCR方法对PRRSV GS株的非结构蛋白基因ORF1进行了分子克隆,并对其核苷酸序列及编码氨基酸进行了分析。结果表明:ORF1全长11 882 bp,其中ORF1a核苷酸长7 512bp,编码2 503个氨基酸,ORF1b核苷酸长4 374 bp,编码1 457个氨基酸。PRRSV GS株ORF1基因与VR-2332株ORF1基因核苷酸同源性较高,其中ORF1a为89.3%,ORF1b为90.7%,而与LV株同源性相比较低,其同源性分别为54.3%和60.8%,相对ORF1a来说,ORF1b较为保守。ORF1编码的产物为2个聚合蛋白,ORF1a所编码的聚合蛋白经水解酶切割后产生6个成熟的非结构蛋白(NSP),其中NSP2变异最大,该蛋白具有耐受碱基插入、突变的能力,可能与PRRSV对组织细胞的亲嗜性有关;ORF1b编码的聚合蛋白经蛋白酶切割后,产生4个成熟的非结构蛋白。从系统发生树分析,PRRSV GS株非结构蛋白基因区域在基因型上属于北美洲型。; 马友记黄连清柳纪省张利; 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒克隆同源性

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