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Nudel基因的克隆及在COS7细胞中的表达研究: 2018年; 本实验克隆并构建了携带红荧光报告基因的Nudel真核表达载体,为后续研究Nudel基因的功能打下基础。查阅Gene card可知,Nudel基因在肺组织中的RPKM值为7.97,本研究以人肺癌细胞A549细胞为材料,提取总RNA并反转录出cDNA,再以cDNA为模板扩增Nudel基因;将目的基因与pMD18-T载体连接,测序鉴定并命名为pT-Nudel;然后再将Nudel基因亚克隆至含红荧光报告基因的载体pDsRed-C1,构建的表达载体命名为pRed-Nudel;提取去内毒素的超纯质粒,转染COS7细胞,检测Nudel的表达情况以及抑癌基因Pten对Nudel表达的影响。结果表明,克隆的Nudel基因经测序鉴定正确;将Nudel基因亚克隆至红荧光表达载体pDsRed-C1,成功构建pRed-Nudel,并在COS7中成功表达。同时观察到与突变型的PtenC124S相比,野生型的Pten有抑制Nudel表达的可能,需要后续的实验进一步验证。; 周子建魏邦毅曾思宇邹志成王鹏汪瑶陈俊; 关键词：CDNA克隆基因表达抑癌基因PTEN COS7细胞

大鼠MKK7真核表达质粒的构建及其在COS7细胞中的转染效率: 2017年; 目的探索大鼠丝裂原活化蛋白激酶激酶7（mitogen activated protein kinase kinase7，MKK7）基因在体外细胞实验中的表达调控规律。方法利用分子生物学方法将大鼠MKK7全长cDNA序列克隆到编码增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，eGFP）和Flag（编码DYKDDDDK亲水性多肽）标签的真核表达载体Pvpl6-AD中，构建出Pvpl6-Flag-MKK7-eGFP重组质粒。通过酶切及DNA测序的方法验证重组质粒序列的正确性后，采用脂质体介导方法将重组质粒瞬时转染COS7细胞，通过荧光显微镜观察质粒与脂质体不同比例情况下以及确定最高转染效率的比例后不同时间段大鼠MKK7基因表达情况。结果成功构建重组真核表达质粒Pvpl6-Flag-MKK7-eGFP。酶切及DNA测序方法确定重组质粒中大鼠MKK7序列与原序列一致。重组质粒与脂质体的比例为1：3时，重组质粒在COS7细胞中的转染效率最高，差异具有统计学意义（P〈0．05）。质粒转染后72h时，COS7细胞中MKK7蛋白表达量相对最高，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论大鼠MKK7重组真核表达载体的构建及其在COS7细胞中转染效率的探索工作为研究大鼠MKK7基因在体外引起细胞分化、增殖、凋亡、炎症反应和应激反应等一系列生物学改变奠定基础。; 代春潇张云山赵小芳王玉兰; 关键词：真核表达质粒转染效率脂质体

人RACK1蛋白在HEK-293T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位被引量：5: 2014年; 目的构建可以表达有活性的蛋白激酶C受体(RACK1)的重组质粒,检测其在细胞内的表达与定位情况。方法设计上下游引物,以RACK1全长cDNA序列为模板,PCR扩增出RACK1序列,分别构建到载体pcDNA3.1和pGEX-5X-3。转染pcDNA3.1-FLAG-RACK1到人胚胎肾细胞(HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞),转化pGEX-5X-3-RACK1到大肠杆菌BL21感受态细胞中表达,Western blot法和考马斯亮蓝染色法检测RACK1表达情况,免疫荧光法研究其细胞内定位。结果成功构建了pcDNA3.1-FLAG-RACK1和GEX-5X-3-RACK1重组质粒。Western blot证明了其在HEK-293T细胞中的表达,考马斯亮蓝染色显示其在BL21菌株也能大量表达,免疫荧光显示RACK1在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论人RACK1在HEK-293T细胞和BL21菌株中均能有效表达,在COS7细胞的胞质、胞核均有分布,为进一步研究人RACK1基因的功能奠定了基础。; 乔正赵健潘林鑫李春雨徐雪琴刘晓颖范礼斌; 关键词：RACK1 基因表达细胞定位 BL21

稳定表达绿色荧光蛋白的COS7细胞系的筛选和鉴定被引量：3: 2012年; 目的构建稳定表达绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)的COS-7细胞系,为相关实验对照提供方便。方法常规方法培养COS-7细胞,将含pEGFP-N3基因的质粒转染COS-7细胞,G418抗性筛选,并用荧光显微镜进行跟踪检测,挑选耐药单细胞克隆并扩大培养至稳定细胞株。结果 G418筛选的最适浓度为500μg/mL。筛选到的COS7-GFP克隆荧光显微镜下发出明亮的绿色荧光,细胞的生物学性状保持稳定,通过Western blot能检测到GFP蛋白。结论成功筛选并建立了稳定表达的COS7-GFP细胞系。; 龙鼎新李小玲温元武; 关键词：GFP 转染细胞克隆

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达被引量：3: 2011年; 背景:体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。目的:构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。方法:采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。结果与结论:重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。; 晏春根黄丹文任光圆朱冬芳; 关键词：热休克蛋白72 基因表达 COS7细胞转录

3*Flag-hPAK4重组质粒的构建及其在COS7细胞中的表达与定位被引量：1: 2011年; 目的:构建3*Flag-hPAK4真核表达质粒,证实融合蛋白在细胞内的表达与定位,并纯化PAK4蛋白。方法:提取人乳腺癌细胞MCF-7 mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hPAK4全长编码基因,亚克隆至含有3*Flag标签的真核表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到非洲绿猴肾成纤维细胞COS7中,提取细胞蛋白进行Western blotting检测,同时利用共聚焦激光扫描显微镜观察3*Flag-hPAK4在COS7细胞内定位。使用免疫沉淀的方法纯化PAK4蛋白。结果:hPAK4全长基因序列克隆到了真核表达载体3*Flag中,酶切鉴定片段为1 800 bp。Western blotting检测到了融合蛋白3*Flag-hPAK4的表达,分子质量约为68 kDa,3*Flag-hPAK4在COS7细胞中表达定位在细胞浆中,成功纯化了PAK4蛋白。结论:成功地构建了3*Flag-hPAK4真核表达质粒,同时鉴定了3*Flag-hPAK4融合蛋白的表达,并纯化了PAK4蛋白。3*Flag-hPAK4蛋白主要定位在细胞浆中。; 张红艳王春玉李彦姝王迪李丰; 关键词：免疫沉淀

探讨Abba1的C端序列对COS7细胞产生ruffling的影响: 2011年; 目的:Abba1在体外实验中能介导细胞产生ruffling,其N端的IMD区域中13个赖氨酸为重要的功能氨基酸位点,但Abba1单独的IMD却不足以介导细胞产生ruffling,本研究旨在初步探讨Abba1的C端序列影响细胞产生ruffling的分子机制。方法:先构建Abba1基因重组表达质粒,分别瞬时转染COS7细胞,通过免疫荧光观察细胞形态改变,并用Western blot检测相应GTP-Rac1的蛋白水平变化。结果:过表达全长Abba1的COS7细胞形成ruffling,与对照组相比,细胞中GTP-Rac1蛋白水平升高(P<0.05);过表达Abba1-IMD和Abba1-del-357-722aa-WH2的COS7细胞不形成ruffling,与对照组相比,相应细胞中GTP-Rac1蛋白水平降低(P<0.05)。结论:Abba1的357-722aa这段区域参与介导细胞产生ruffling,而且这种影响与GTP-Rac1蛋白水平的降低有关。; 陈燕萍崔伯塔郑大同王卓璎崔晓利鲁翔; 关键词：IMD RAC1

过表达Abba1重组表达质粒对COS7细胞膜结构影响的实验研究: 背景和目的:细胞运动是人类生命活动中重要的病理生理基础,与衰老、血管新生和肿瘤转移密切相关。细胞膜结构重塑是细胞运动的重要结构基础,主要包括胞膜突起、凹陷和管状结构的形成。在胞膜突起结构中根据形态和直径大小可以大致分为m...; 陈燕萍; 关键词：IMD RAC1; 文献传递

脊髓损伤修复相关10号蛋白在COS7细胞中的表达、纯化与鉴定被引量：1: 2010年; 目的:在COS7细胞中表达脊髓损伤修复相关10号蛋白(SCIRR10),并对表达产物进行纯化和鉴定。方法:在实验室前期研究基础上,用PCR方法扩增SCIRR10基因,将其克隆入pcDNA3.1/myc-HisA穿梭质粒中,转染COS7细胞进行表达;对表达产物用金属螯合层析方法纯化,并进行SDS-PAGE和Western印迹检测。结果及结论:构建了含有SCIRR10基因的穿梭质粒pcDNA3.1/myc-His-SCIRR10,并使其在COS7细胞中得到表达,纯化后的重组蛋白SCIRR10-His-myc的纯度在80%以上,可用于下一步的实验研究。; 唐宁阙海平刘少君; 关键词：真核表达 COS7细胞金属螯合层析

鼠OAZ1基因的真核表达质粒的构建及其在COS7细胞中的表达: 2010年; 构建鼠OAZ1基因真核表达质粒,观察OAZ1-GFP融合蛋白在绿猴肾细胞COS7中的表达。利用RT-PCR的方法获得鼠OAZ1基因,再利用重叠延伸PCR缺失掉OAZ1序列中的205位碱基T,由此获得无需阅读框移码即可编码全长OAZ1的突变基因。将此突变基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1获得重组质粒pEGFP-N1-OAZ1-T。将此质粒瞬时转染COS7后,采用RT-PCR,Western blotting,免疫荧光技术观察检测目的基因的表达情况。结果显示,酶切和测序证明质粒pEG-FP-N1-OAZ1-T构建正确,转染COS7细胞后,OAZ1-GFP融合蛋白能在细胞中高效表达。成功构建了pEGFP-N1-OAZ1-T真核表达质粒,在COS7细胞内,该质粒能成功指导OAZ1-GFP融合蛋白合成。; 刘梦瑶韩钰蔡富强何玲王艳林; 关键词：多胺代谢融合蛋白真核表达

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