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竞争ELISA 和间接ELISA 方法 应用于牛布鲁氏菌病净化的研究 被引量：3 2024年 ELISA 方法 和间接ELISA 方法 联合使用在布鲁氏菌病(以下简称“布病”)净化中的效果,为布病防控提供技术支撑。采用本实验室开发的动物布鲁氏菌病竞争ELSIA(cELISA )抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA (iELISA )抗体检测试剂盒及微量法补体结合试验(mCFT),对西北某牛场3 271份牛血清进行检测。本研究采用cELISA 初筛、iELISA 确诊的净化策略,对检测阳性牛进行淘汰,可疑牛和阴性牛在完全消毒后隔离饲养,并在前一次检测后每隔1个月重新对群体采样,进行多次连续的“检—淘”策略,在群体的个体阳性率低于2%或全部转阴后使用微量补体结合试验(mCFT)进行验证。并在群体全部转阴后继续检测2个月后确定净化结果。结果显示,首次检测阳性率35.36%的感染群体实施本净化策略后,在第1个月阳性率下降至25.41%,第2个月下降至7.16%,第3个月下降为1.86%,到第4个月则实现了布病阳性群体的全面转阴,mCFT验证个体阴性率100%。此后持续检测2个月,个体阳性率均为0,至此实现了感染群体的布病净化,使得群体内近一半的牛免于扑杀,大大减少了经济损失。综上发现,将cELISA 用于布病初筛,iELISA 用于布病确诊的联合使用,经多次连续检测并结合常规的隔离消毒措施,可以在短时间内实现对于布病感染群体的全面净化。关键词：布鲁氏菌病 初筛 确诊 刚地弓形虫MIC2蛋白的表达及间接ELISA 方法 的建立 2024年 ELISA (indirect ELISA ,iELISA )方法 ,并通过重复性、敏感性、特异性实验评价该方法 ,并对田间样品进行检测。结果显示,抗原最佳包被量为0.5μg/孔,血清稀释度为1∶100,临界值为0.7130时,该方法 的敏感性为81.25%,特异性为100%。批内与批间重复变异系数均低于或在10%左右,具有良好的重复性;与猫沙门菌和猫细小病毒阳性血清均无交叉反应,特异性好。使用MIC2-iELISA 方法 和弓形虫全裂解抗原(T.gondii whole lysis antigen,TLA)建立的iELISA 方法 检测扬州地区的48份田间猫血清样本,符合率为93.75%。本研究基于重组MIC2蛋白建立了一种新的间接ELISA 方法 ,该方法 可用于猫弓形虫病的初步诊断。关键词：弓形虫病 间接ELISA 重组蛋白 狐源兔脑炎微孢子虫极管蛋白2(PTP2)的原核表达及间接ELISA 方法 的建立 2024年 ELISA 方法 ,试验首先从疑似感染兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon.cuniculi)的蓝狐脑组织DNA中扩增PTP2基因,并将其与原核表达载体pET-32a(+)连接,构建重组质粒pET32a-PTP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,将菌体超声后对表达的重组蛋白进行可溶性分析,并纯化目的蛋白;然后以重组蛋白作为包被抗原,通过优化反应条件和临界值的确定建立蓝狐兔脑炎微孢子虫的间接ELISA 方法 ,并进行特异性、敏感性和重复性试验;最后采用建立的间接ELISA 方法 对28份经常规PCR方法 验证已经感染兔脑炎微孢子虫病的蓝狐血清样品进行检测,并计算符合率。结果表明:表达的重组蛋白的分子质量为45.8 ku,且表达产物以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,经纯化杂带明显减少,纯化后的重组蛋白质量浓度为1.55 mg/mL。间接ELISA 方法 的最佳包被抗原质量浓度为8μg/ml,最佳一抗稀释度为1∶100,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳封闭条件为37℃、1 h,最佳一抗孵育时间为120 min,最佳二抗稀释度为1∶5 000,最佳二抗孵育时间为60 min,最佳显色时间为20 min。阴、阳性血清OD_(450)临界值分别为0.268和0.302。建立的间接ELISA 方法 检测蓝狐犬瘟热病毒、蓝狐伪狂犬病毒、蓝狐细小病毒阳性血清均为阴性,可检测到稀释度为1∶3 200的蓝狐兔脑炎微孢子虫阳性血清,批内重复与批间重复变异系数均小于10%。用建立的间接ELISA 方法 检测28份蓝狐血清样品的阳性样品数为23份,与常规PCR方法 的符合率为82.14%。说明试验成功建立了一种可检测蓝狐兔脑炎微孢子虫病的间接ELISA 方法 ,该方法 特异性好、敏感性高、重复性好,适合在基层推广。关键词：原核表达 间接ELISA 猪弓形虫病阻断ELISA 方法 的建立及初步应用 2024年 ELISA 方法 。以rGRA7重组蛋白免疫小鼠,取脾细胞进行细胞融合,筛选出4株能够稳定产生单克隆抗体的阳性单克隆细胞株。经对此单克隆抗体进行IFA和Western blot检测确认成功制备GRA7蛋白的单克隆抗体后,以重组蛋白为包被抗原对阻断ELISA 方法 进行优化后,经过重复性、交叉性、符合性实验验证本方法 具有可重复性,与MAT符合性高。初步应用于288份临床样品检测,检出率为11.46%,与MAT检测结果重合率为84.8%。本研究成功制备弓形虫GRA7蛋白的单克隆抗体,并建立了一种猪弓形虫病的阻断ELISA 方法 ,为弓形虫病的检测提出了新的方案。关键词：弓形虫 单克隆抗体 阻断ELISA 基于FIPV S蛋白单抗的竞争ELISA 方法 建立及应用 2024年 ELISA 法。优化结果表明最佳条件为:包被抗原质量浓度10μg/mL,血清稀释度1∶4;FIPV MAb 3D8稀释倍数1∶100,酶标二抗稀释倍数1∶5000;CBS在37℃包被1 h,5%BSA在37℃封闭2 h,FIPV MAb 3D8在37℃孵育1 h,TMD底物显色液37℃避光5 min。临界值PI≥25.76%时为阳性,PI<20.22%为阴性。该方法 特异性较强,重复性较好。利用该方法 和已发表的其他方法 同时对来自宠物医院的62份临床血清样本进行检测,总体符合率为85.5%,表明该方法 准确性较高。本研究建立了快速准确测定FIPV抗体的竞争ELISA 方法 ,适用于临床样本检测,为猫传染性腹膜炎的鉴定、防控和流行病学调查提供支持。关键词：竞争ELISA 单克隆抗体 基于N蛋白小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA 方法 的建立 2024年 方法 ,本研究将pET-32a-N重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达、纯化获得重组蛋白并免疫BALB/c小鼠,制备了抗PPRV-N蛋白的单克隆抗体并进行HRP标记,通过优化反应条件建立了PPRV阻断ELISA 抗体检测方法 。经评价该方法 与PIV、GTPV、ORFV的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶160稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(Cv)均小于10%;通过对180份临床血清样品进行检测,该方法 与竞争ELISA 试剂盒的符合率为96%。表明建立的阻断ELISA 方法 具有良好的特异性、敏感性与可重复性,可用于PPRV抗体的检测,为PPRV疫苗的免疫效果评估及疫病防控提供了技术支持。关键词：小反刍兽疫 N蛋白 阻断ELISA 罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白的表达及IgM抗体间接ELISA 方法 的建立 2024年 ELISA 方法 ,试验首先进行了罗非鱼源无乳链球菌ScpB基因的克隆及其蛋白的表达和纯化,然后以重组蛋白作为包被抗原、罗非鱼待测血清作为一抗、抗罗非鱼IgM单克隆抗体2C10作为二抗、羊抗鼠IgG-HRP作为三抗建立间接ELISA 方法 并对该方法 进行条件(抗原包被质量浓度、一抗稀释度、抗原包被条件、封闭液、一抗作用时间、二抗作用时间)优化,最后确定该方法 的临界值并进行特异性、敏感性、重复性和符合性试验。结果表明:纯化后的罗非鱼源无乳链球菌ScpB蛋白大小为104.6 ku,与预期大小一致,可被罗非鱼IgM抗体特异性识别;建立的IgM抗体间接ELISA 方法 的最佳抗原包被质量浓度为0.1μg/mL,最佳一抗稀释度为1∶5,最佳抗原包被条件为4℃、12 h,最佳封闭液为5%脱脂乳,最佳一抗作用时间为2 h,最佳二抗作用时间为0.5 h;临界值上限为0.456,临界值下限为0.377;批内变异系数为3.349%~5.272%,批间变异系数为2.793%~5.902%,均低于10.000%;仅可检测出罗非鱼无乳链球菌阳性血清和罗非鱼ScpB蛋白免疫血清,无法检测出罗非鱼嗜水气单胞菌阳性血清、罗非鱼荧光假单胞菌阳性血清、罗非鱼海豚链球菌阳性血清和罗非鱼鳗弧菌阳性血清;待测血清最大稀释度为1∶640;与无乳链球菌全菌包被ELISA 检测方法 比较,阳性率略低,符合率为83.43%。说明本研究建立的罗非鱼源无乳链球菌IgM抗体间接ELISA 方法 具有良好的特异性、敏感性、重复性和准确性。关键词：无乳链球菌 罗非鱼 IGM ELISA 非洲马瘟病毒VP7蛋白的可溶性表达及抗体阻断ELISA 方法 的初步建立 2024年 ELISA 抗体检测方法 ,通过对编码AHSV VP7蛋白的基因序列进行突变设计与密码子优化,以大肠杆菌表达系统表达可溶性VP7蛋白并进行纯化,免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得VP7蛋白单克隆抗体。通过细胞免疫荧光和Western-blot鉴定单克隆抗体的特异性,并建立AHSV VP7阻断ELISA 方法 。结果显示,利用大肠杆菌表达系统成功表达了可溶性重组AHSV VP7蛋白,将纯化的VP7蛋白免疫小鼠筛选制备了2株稳定分泌VP7蛋白单克隆抗体的细胞株,分别为3F7和7H8。经鉴定证明这2株VP7单克隆抗体不仅能与大肠杆菌重组表达的VP7蛋白反应,而且也与BHK-21细胞表达的具有天然构象的重组VP7蛋白反应,具有良好的特异性和反应性。以重组VP7蛋白和单克隆抗体7H8分别为包被抗原和阻断抗体建立了AHSV VP7阻断ELISA 方法 ,检测了277份马血清样本,结果与商品化进口AHSV抗体检测试剂盒测定结果一致。本研究在大肠杆菌表达系统中实现了AHSV VP7蛋白的可溶性表达,制备获得了VP7特异性单克隆抗体,并建立了AHSV VP7阻断ELISA 方法 ,为我国有效防控非洲马瘟的传入提供了技术储备。关键词：非洲马瘟病毒 VP7蛋白 可溶性表达 单克隆抗体 阻断ELISA 产气荚膜梭菌α-β2-ε融合蛋白原核表达及其间接ELISA 方法 的建立 2024年 ELISA )是诊断疫病及抗体检测的重要手段。【目的】表达重组α-β2-ε融合蛋白,并以此为靶抗原建立间接ELISA 抗体检测方法 ,为临床检测牦牛C.perfringens及流行病学调查提供技术支持。【方法 】利用生物信息学软件(EditSeq、Protean)和Jameson-Wolf方法 分析牛源C.perfringens的α、β2和ε蛋白抗原指数,截取抗原指数较高肽段并用柔性Linker连接,经密码子优化后克隆至载体pET-32a(+),构建重组表达质粒pET-32α-β2-ε,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)感受态细胞,经培养、诱导表达、纯化后采用SDS-PAGE和Western blotting鉴定。以重组α-β2-ε融合蛋白作为包被抗原,经棋盘法和控制单一变量法优化反应条件,建立间接ELISA 抗体检测方法 ,通过受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线确定临界值并对其敏感性、特异性、重复性和临床效果进行评价。【结果】α的241‒403肽段、β2的161‒355肽段、ε的154‒331肽段抗原指数较高,将它们连接并融合表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定融合蛋白表达正确。ELISA 抗体检测方法 最佳工作条件为:抗原包被浓度5μg/mL 4℃过夜或37℃孵育60 min;5%脱脂乳于37°C封闭1 h;血清稀释度为1:150于37°C孵育30 min;酶标二抗1:2000于37°C孵育30 min;避光显色10 min。检测临界值为0.4702;敏感性高,可检测阳性血清最大稀释度为1:3200;特异性强,与溶血性曼氏杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等阳性血清均无交叉反应;重复性好,批内和批间变异系数均小于10%。四川省甘孜藏族自治州部分地区共277份牦牛血清样品检测结果显示,C.perfringens抗体阳性率为89.89%,与商品化产气荚膜梭菌α毒素ELISA 检测试剂盒检测结果基本一致。【结论】成功制备重组α-β2关键词：产气荚膜梭菌 Α毒素 间接ELISA 猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白原核表达及间接ELISA 方法 的建立 2024年 ELISA 方法 ,通过PCR扩增N蛋白基因,将N蛋白基因克隆至原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。将重组质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞中,通过IPTG诱导N蛋白表达,将纯化后的重组N蛋白免疫小鼠,获得N蛋白多克隆抗体。将纯化后的N蛋白作为抗原,建立检测PRRSV N蛋白抗体的间接ELISA 方法 ,并评估该方法 的特异性、重复性和准确性。结果表明,表达的重组N蛋白呈可溶性,制备的N蛋白多克隆抗体ELISA 效价能达到1∶2048000,IFA和Western blot结果表明制备的鼠多克隆抗体能特异性识别PRRSV N蛋白。建立的间接ELISA 方法 特异性良好,重复性试验变异系数均小于10%,且与同类型商品化试剂盒结果比较,符合率达到91.10%,可为PRRSV N蛋白的免疫学检测和结构功能的研究提供参考。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 原核表达 间接ELISA
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