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疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的基因组挖掘与表达: 2024年; 基因组挖掘是发现生物催化剂的高效工具,开发热稳定性β-葡萄糖苷酶具有重要的应用价值.该文采用基因组挖掘策略,从嗜热真菌疏绵状嗜热丝孢菌的基因组中挖掘出7个注释为β-葡萄糖苷酶基因或β-葡萄糖苷酶预测蛋白基因,其中TLG-1、TLG-2、TLG-4、TLG-5、TLG-6属于GH3家族,TLG-3和TLG-7分别属于GH1家族和GH17家族,且TLG-7与GenBank数据库已有序列的同源性很低,只有48.43%.选择同源性低的、同源序列被研究少的TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7进行基因克隆和毕赤酵母异源表达,重组毕赤酵母经甲醇诱导表达后,用发酵液上清进行SDS-PAGE分析,结果表明TLG-2、TLG-5、TLG-6和TLG-7均成功分泌表达.对发酵液进行β-葡萄糖苷酶活力测定结果表明:TLG-2的活力最高,达到166.6 U·mL^(-1);其次是TLG-5的活力,其值为79.8 U·mL^(-1),TLG-6和TLG-7的活力较低,分别为9.9 U·mL^(-1)和9.5 U·mL^(-1).研究结果为疏绵状嗜热丝孢菌β-葡萄糖苷酶的应用奠定了基础.; 黎小军杨丽英彭琛琛郑建永; 关键词：Β-葡萄糖苷酶疏绵状嗜热丝孢菌异源表达

VKT多肽介导的固定化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化制备生物柴油: 2024年; 生物柴油是一种环境友好的生物液体燃料,对于酶法生产生物柴油,迫切需要找到廉价和高效的固定化脂肪酶。本研究利用固体结合肽(SBPs)VKT,将其与疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)融合构建融合脂肪酶,并将其固定化在硅基材料上,获得了一种新型的生物催化剂。在所测试的硅基材料(ZSM-5、Na-Y、SAR-100、MCM-41和SiO_(2)微粉)中,固定在ZSM-5沸石上的TLL-VKT(TLL-VKT@ZSM-5)表现出最佳的固定化效率和最大负载,且具有优异的pH、温度、储存和洗脱稳定性。以TLL-VKT@ZSM-5为生物催化剂,对麻疯树籽油进行转酯化反应,48h生物柴油得率即达到93.9%。此外,TLL-VKT@ZSM-5还表现出较高的重复使用性能,在7次重复使用后,生物柴油得率依然保持71.9%。本研究的酶固定化方法具有简单高效、稳定性高和重复使用性能高等优点。本研究显示VKT肽在酶蛋白固定化的应用方面具有较好前景。; 季骁彦许蕊王飞李迅; 关键词：固定化麻疯树籽油生物柴油

基于半理性设计提高疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶催化特异性被引量：1: 2023年; 甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物,在人体中具有重要的生理功能,主要通过脂肪酶水解油脂制备。但对1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少,限制了其广泛应用。基于以上问题,本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用,优化检测分析参数,建立了1,2-DAG(0.025–0.200 g/L)和1,3-DAG(0.025–0.150 g/L)的高效定量检测方法。进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接,挑选了5个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库,利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选。突变文库中I202V表现出最高的1,3-位置选择特异性,较野生型TLL提高了11.7%。本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造,并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法,为脂肪酶催化特异性研究提供了参考。; 马亚迪尤翠萍张国强李江华李江华; 关键词：脂肪酶甘油二酯超临界流体色谱位置异构体

Thermomyces lanuginosus脂肪酶催化特异性检测方法开发与分子改造研究: 脂肪酶(lipase,E.C.3.1.1.3)是目前应用最广泛的酶之一,可以催化酯化、水解等反应。具有sn-1,3区域选择性的脂肪酶可以特异性的在甘油骨架sn-1、sn-3位上催化反应,可以用于甘油二酯(diacylgl...; 马亚迪; 关键词：脂肪酶甘油二酯超临界流体色谱位置异构体

末端环化疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶的稳定性: 2022年; 目的:获取活性高、稳定性好的工业脂肪酶。方法:利用哺乳动物细胞和大肠杆菌分别表达Butelase 1和梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL),通过Flag亲和层析和His亲和层析柱进行纯化;通过纯化的Butelase 1连接酶对重组TLL(rTLL)进行末端连接,以形成首尾相连的环状TLL(cTLL),通过测定rTLL和cTLL活性、热稳定性、蛋白酶稳定性、抗热聚沉能力等,研究环化处理对脂肪酶的影响。结果:纯化后cTLL与rTLL的比活基本相当;70℃下处理180 min,cTLL大部分可保持可溶状态,相同条件下线性蛋白TLL几乎完全沉淀或降低;环化后的脂肪酶cTLL粒径均一、分子量分布均匀,具有更稳定的蛋白特性。结论:Butelase 1可有效地环化梳棉状嗜热丝孢菌脂肪酶,环化后的蛋白酶酶活未改变,热稳定性大大提高,蛋白特性更好。; 宋文武霞霞娄海伟方惠敏; 关键词：环化稳定性

计算机辅助设计提高疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶热稳定性的研究: 2022年; 本文对疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)进行计算机辅助设计以期提高其热稳定性,借助Rosetta旗下自由能计算模块ddg_monomer得出三个突变体(T114W、R175W、R195W)的自由能变化相对野生型TLL小于-5 kcal/mol,预测其可能为热稳定性提高的脂肪酶突变体。将TLL及突变体利用毕赤酵母真核表达系统进行异源表达后,对其酶学性质进行研究比较。结果表明:突变体T114W和R195W在70℃下处理90 min后相对剩余酶活较野生型TLL分别提高了13.46%和22.88%;在80℃下处理30 min后突变体T114W的相对剩余酶活较野生型TLL提高了17.26%。除此之外,突变体T114W和R195W的转酯率较野生型提高了15.12%和8.50%。本研究证明利用计算机辅助设计提供潜在耐热TLL突变体的研究策略是有效可靠的,研究产生的耐热突变体T114W和R195W也能被用于极端条件下的工业生产中,且该研究也为提高工业用耐热性酶提供了参考依据。; 万思迪苗华彪韩楠玉; 关键词：计算机辅助设计脂肪酶定点突变热稳定性

疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的理性设计提高其活性和温度稳定性被引量：2: 2021年; 目的:通过对疏棉状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)脂肪酶的理性设计,获得高酶活与耐高温的脂肪酶品种,为脂肪酶在饲料、油脂加工和生物柴油等领域的应用奠定基础。方法:对脂肪酶典型结构域lid和loop区域的系统发育分析,找到候选的位点,理性设计并通过实验验证,获得脂肪酶活性和耐高温特性显著提高的脂肪酶重组子,并构建多拷贝载体,完成50L发酵罐中进行产酶能力评价。结果:经过设计的脂肪酶高温稳定性显著提升。其在80℃下放置12h后仍保留78.94%的酶活。脂肪酶重组子在50L发酵罐中发酵诱导168h,其上清液酶活达到29000U/m L。结论:成功设计并获得了一种新型的高活性、耐高温的脂肪酶品种TLL,并实现了高效表达,为其产业化和工业应用奠定了基础。; 魏子翔张柳群雷磊韩正刚杨江科; 关键词：脂肪酶高活性高温稳定性

重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶对面包烘焙品质的影响被引量：5: 2020年; 为探究重组疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Recombinant Thermomyces lanuginosus Lipase Produced by Pichia pastoris,PTL)在面包体系中的使用效果,试验以面包比容、组织结构以及面包芯白度为指标得出其最佳用量。进一步研究比较PTL、商业脂肪酶Lipopan F BG(以下简称FBG)、化学改良剂双乙酰酒石酸单(双)甘油酯(Diacetyl Tartaric Acid Ester of Mono(di)Glycerides,DATEM)对面包烘焙品质的影响,对面团面筋网络结构及面包芯风味物质分别采用扫描电镜(Scanning Electron Microscope,SEM)和顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用法(Head-Space Solid Phase Micro-Extraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometer,HS-SPME-GC-MS)进行分析。结果表明,PTL在面包中的最佳用量为10~20 mg/kg,过量PTL造成不良影响。PTL在增大面包比容、强化面筋结构和提高感官整体接受度等方面仅次于FBG,优于DATEM。面包配方中加入15 mg/kg PTL能明显增大面包比容(9.8%),降低面包硬度,气味和组织结构的感官得分最佳(6.48分和6.82分)。综上,适量PTL能有效改善面包的烘焙品质且具有不同于商业酶的独特优势。; 钱忠英刘滔杨环毓蔡海莺冯凤琴; 关键词：面包风味物质

疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因在毕赤酵母工程菌中的遗传稳定性被引量：1: 2019年; 【背景】重组工程菌的传代稳定性是保证外源蛋白高效稳定表达的前提,是决定工业化生产能力的关键因素之一。【目的】对异源的疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶基因在毕赤酵母重组工程菌中的遗传稳定性进行研究。【方法】将工程菌连续传代15次,取第1、5、10、15代作为受检代次,结合重组菌的菌落及菌体形态、水解酶活、目的基因片段、外源基因拷贝数等指标综合评价其遗传稳定性。【结果】传代过程中重组菌的菌落和菌体形态、目的蛋白分子量、目的基因序列均保持一致。目的基因的整合拷贝数经5次传代后发生一定损失,但随后稳定为7左右,而脂肪酶的相对酶活则提高至90%以上。【结论】适量的整合拷贝数更有利于该脂肪酶基因在毕赤酵母重组菌中的表达,经综合评价此工程菌的遗传稳定性良好,应用于工业化大规模生产是可行的。; 钱忠英李杨蔡海莺冯凤琴; 关键词：毕赤酵母脂肪酶重组菌

疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶在毕赤酵母中的高效表达和性质鉴定被引量：1: 2018年; 通过密码子优化改造编码sn-1,3位置专一性疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶(TLL)基因,同时通过重叠PCR技术合成该基因,并将其克隆到巴斯德毕赤酵母的表达载体p PIC9K中。结果表明,TLL脂肪酶被高效胞外表达,在摇瓶中发酵168 h得到的发酵液的上清脂肪酶表达量达到0.1 mg/m L,对应的p NPP水解酶活达到312.72U/m L。与对应的原始编码基因重组菌酶活(179.42 U/m L)相比,密码子优化后酶活提高74.29%,表明密码子优化策略成功提高了TLL在巴斯德毕赤酵母中的重组表达。比较毕赤酵母来源的重组TLL与商业化的米曲霉酶学性质发现它们具有相似的最适p H和温度耐受范围。另外,它们在有机溶剂耐受性、表面活性剂和金属离子效应以及位置选择性方面均较为相似,表明毕赤酵母来源的重组TLL同样具有商业化应用的潜力。; 蔡海莺张婷Dumba Trish赵敏洁李杨童志超毛建卫张辉冯凤琴; 关键词：密码子优化毕赤酵母

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