搜索到119篇“ T细胞系“的相关文章
- 高表达H2型人类组织血型抗原HEK-293T细胞系的构建及其应用
- 2024年
- 目的通过在人胚肾-293T(human embryo kidney-293T,HEK-293T)细胞中过表达岩藻糖转移酶2(fucosyltransferases 2,FUT2)基因,进而催化诺如病毒受体人类组织血型抗原(histo-blood group antigen,HBGA)的形成,构建介导诺如病毒和受体发生相互作用的细胞系。方法构建FUT2慢病毒质粒,采用Lipofectamine 2000将FUT2慢病毒质粒及pMD.2G和psPAX2包装质粒共转染HEK-293T细胞,收获慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染对数生长期的HEK-293T细胞,嘌呤霉素加压筛选获得HEK-293T/FUT2细胞系。PCR鉴定FUT2基因是否整合到基因组中,RT-qPCR检测HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA转录水平,流式细胞术分析HEK-293T/FUT2细胞HBGAs的表达,间接免疫荧光法分析HEK-293T/FUT2细胞与诺如病毒病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的结合活性。结果成功构建了序列正确的慢病毒质粒PLVX-IRES-Puro-FUT2,并获得了慢病毒颗粒。慢病毒颗粒感染HEK-293T细胞后,通过嘌呤霉素加压筛选获得了HEK-293T/FUT2细胞系,PCR验证显示,FUT2基因成功整合到HEK-293T细胞基因组中。HEK-293T/FUT2细胞FUT2 mRNA水平提高了330倍。99.9%的HEK-293T/FUT2细胞表达H2型人类组织血型抗原。GI.1重组诺如病毒VLP可以与HEK-293T/FUT2细胞产生很好的结合反应,EC50为2.007μg/mL。结论建立了H2型人类组织血型抗原稳定高表达的HEK-293T细胞系,并基于该细胞系初步建立了GI.1型重组诺如病毒VLP结合活性评价方法。
- 秦海艳谢忆张巧玲马素娟李晨杨林鹏付艳丽李奇蒙杨俊杰
- 关键词:诺如病毒结合活性
- 表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系构建方法及应用
- 本发明公开了表达ACE2蛋白的HEK293T细胞系构建方法及应用,属于分子生物学中的基因工程和细胞工程技术领域,包括以下步骤:第一步、ACE2基因序列合成及慢病毒载体构建;第二步、慢病毒包装;第三步、慢病毒感染及药筛;第...
- 刘登辉周金山施荣辉
- 稳定表达马NLRP3 HEK293T细胞系的构建及用于马NLRP3炎性小体的研究被引量:1
- 2024年
- 为构建稳定表达马NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(eqNLRP3)的细胞系,并用于eqNLRP3炎性小体激活的研究,本研究采用同源重组的方法将经PCR扩增的eqNLRP3和GFP基因克隆至pLPCX中,构建重组表达质粒pLPCX-Flag-eqNLRP3-GFP,经PCR和测序鉴定正确后与pCGP、pVSV-G共转染HEK293T细胞,48 h后获得携带eqNLRP3的慢病毒。将该慢病毒感染HEK293T细胞,并采用嘌呤霉素筛选携带绿色荧光(GFP+)的单克隆细胞。采用western blot鉴定该细胞中eqNLRP3蛋白的表达、反应原性及细胞遗传稳定性。Western blot结果显示在146.1 ku处出现特异性条带,且传至1、4、7、10代的细胞均出现该条带,表明获得稳定表达eqNLRP3蛋白的HEK293T细胞系HEK293Teq NLRP3(2G1细胞)。采用NLRP3特异性激活剂尼日利亚菌素(Nig)处理2G1细胞1 h;将表达质粒pCDNA3.1-eqASC-HA转染2G1细胞,加入Nig处理1 h,采用激光共聚焦显微镜分别观察上述细胞中e NLRP3的聚化状态,及在2G1细胞中表达eqASC后能否形成ASC斑点(eqNLRP3-eqASC的复合物,即NLRP3炎性小体激活的典型特征)。结果显示,正常2G1细胞中呈绿色荧光的eqNLRP3弥散分布于细胞质中,加入Nig后弥散的eqNLRP3在细胞质中形成典型绿色荧光的点状聚集。转染表达eqASC质粒的2G1细胞中出现的红色荧光(eqASC)主要在细胞质中呈弥散性分布;转染表达eqASC的2G1细胞用Nig处理后形成2.5μm的中间呈绿色荧光四周呈红色荧光的典型ASC斑点。上述结果表明2G1细胞可以响应特异性激活剂并诱导eqNLRP3的聚化,招募ASC形成ASC斑点。将本实验室构建的iGLuc报告系统中的4种表达炎性小体蛋白质粒分别与EIV各蛋白对应质粒共转染HEK293T细胞,24 h后利用该报告系统检测各组细胞中的荧光素酶活性;采用western blot检测各共转染细胞中各EIV蛋白的表达对该系统中4种炎性小体蛋白表达的影响,通过上述两个试验筛选能够激活eqNLRP3炎性小体的EIV蛋白。iGLuc报
- 夏慧娟李鸿鑫林跃智王晓钧
- 关键词:稳定细胞系
- POLQ基因敲除293T细胞系的构建及其在外源基因定点整合中的应用
- 2024年
- 目的:利用CRISPR/Cas9技术构建POLQ基因敲除293T细胞系,并探讨该敲除细胞系在外源基因定点整合方面的应用。方法:构建靶向POLQ基因的pX330-sgRNA打靶载体,通过T7EI酶切验证,选取打靶效率最高的载体,转染293T细胞;利用流式细胞分选术、稳定单细胞克隆培养、TA克隆测序及蛋白质印迹等方法验证POLQ敲除情况;利用靶向AAVS1和FBL位点的含GFP/mCherry报告基因同源打靶载体,评估敲除的293T POLQ-/-细胞系在外源基因定点整合效率的变化,并通过测序方式验证供体报告载体是否定点整合到基因组中;最后分析POLQ敲除对293T细胞增殖和存活率的影响。结果:成功在293T细胞中稳定敲除POLQ基因;通过报告基因实验验证,敲除细胞系中外源基因定点整合效率平均提高2~7倍,且敲除POLQ基因对293T细胞系增殖和存活率没有明显影响。结论:成功利用CRISPR/Cas9技术构建具有高效定点整合能力的POLQ基因稳定敲除293T细胞系,为进一步利用该细胞系高效制备稳定整合外源基因(包括抗体基因)工程化细胞系奠定基础。
- 王瑶姜志洋蔡军雨樊榕榕贾姗姗冯健男石艳春王晶郑源强
- 关键词:293T细胞基因敲除
- 稳定表达PDCoV-S和RBD蛋白的293T细胞系构建与免疫原性评价
- 2024年
- 为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S和RBD蛋白的293T细胞系,获得PDCoV S和RBD蛋白。本研究将优化合成的PDCoV S蛋白全长基因及其RBD的表达质粒进行双酶切鉴定,将重组质粒pLV-S-Puro、pLV-RBD-Puro、psPRX2、pMD2.G同时转染293T细胞中进行慢病毒包装,收集上清感染293T细胞,经嘌呤霉素初筛得到的多细胞克隆,进一步通过终点稀释法筛选获得稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的单克隆293T细胞系,通过Western blot检测蛋白表达,用纯化的PDCoV S和RBD蛋白分别免疫BALB/c小鼠,对重组蛋白进行免疫原性检测。结果表明,稳定表达PDCoV S和RBD蛋白的293T细胞系构建成功,获得了重组慢病毒,纯化PDCoV S和RBD重组蛋白均可以诱导小鼠产生较高的IgG抗体(S:1.2;RBD:0.9),中和抗体水平分别达1∶128和1∶64。本研究构建的293T细胞系能稳定表达PDCoV S和RBD蛋白,为进一步研制PDCoV亚单位疫苗奠定了基础。
- 肖丽赵淑庆袁雪松范丽原易鑫陈琢琦李彬李基棕李彬
- 关键词:慢病毒
- 过表达JMJD6基因的293T细胞系的构建及对水疱性口炎病毒增殖效率的评价
- 2024年
- 为提高水疱性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)在细胞中的增殖效率,本研究利用慢病毒包装系统构建Jumonji C结构域蛋白6(Jumonji domain-containing protein 6,JMJD6)过表达的HEK-293T/JMJD6细胞系,分析VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系与HEK-293T细胞中的复制差异。首先以JMJD6基因为目标,构建重组质粒pLV-puro-3×Flag-JMJD6,并与辅助质粒pMD2.G和psPAX2共转染至HEK-293T细胞进行慢病毒包装。将包装好的慢病毒感染HEK-293T细胞并通过嘌呤霉素筛选获得过表达JMJD6基因的阳性细胞。利用Western-blot、间接免疫荧光试验、流式细胞术和蚀斑试验检测VSV在HEK-293T/JMJD6细胞系中的复制能力。结果显示,在HEK-293T/JMJD6细胞系中,VSV的复制能力显著增强。实时荧光定量检测VSV感染的HEK-293T/JMJD6细胞系和野生型HEK-293T细胞中干扰素下游基因的表达,结果显示HEK-293T/JMJD6细胞系抑制VSV诱导的Ⅰ型干扰素下游基因的产生。总之,本研究构建的HEK-293T/JMJD6细胞系能显著促进VSV的增殖并抑制Ⅰ型干扰素信号通路,为VSV疫苗候选细胞株的筛选奠定了基础。
- 黄梦瑶杨帆杨洋杨洋王家丽吕岳芹赵晓义陈治彤曹伟军张伟曹伟军
- 关键词:水疱性口炎病毒干扰素
- 稳定表达小鹅瘟病毒VP3基因的293T细胞系构建被引量:1
- 2023年
- 为构建稳定表达鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)VP3基因的293T细胞系,利用PCR技术扩增GPV的VP3基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1-GPV-VP3,再将其转染至293T细胞,并利用博来霉素(zeocine)进行药物压力筛选。结果表明,获得的293T细胞系能够高效表达VP3蛋白,这为小鹅瘟病毒VP3蛋白的生物学功能的深入研究以及鹅细小病毒抗体检测方法的建立提供良好的生物材料。
- 乔丹丹刘婷隽陈全刚胡安康
- 关键词:鹅细小病毒VP3基因真核表达载体293T细胞
- G3BP1^(-/-)293T细胞系的构建及其影响塞内卡病毒A复制的研究
- 2023年
- 本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建G3BP1基因稳定敲除的293T细胞系,对塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)的增殖特性进行初步研究。设计、构建靶向G3BP1基因的sgRNA表达载体,转染293T细胞,经过Western-blot、基因测序筛选鉴定G3BP1敲除细胞系,CCK-8法检测细胞增殖速度;荧光定量RT-PCR方法检测SVA感染后基因组拷贝数,Western-blot检测病毒蛋白VP1表达水平;间接免疫荧光(IFA)检测敲除G3BP1基因对细胞内应激颗粒形成的影响。结果显示,筛选出1株G3BP1基因缺失5 bp的293T细胞(G3BP1-/-293T),其增殖速度与正常细胞相比未见显著差异;荧光定量RT-PCR结果和Western-blot结果表明,在病毒感染早期,敲除G3BP1基因显著抑制SVA基因组复制和病毒蛋白表达;IFA结果显示,敲除G3BP1基因不会影响其细胞内应激颗粒的形成,表明G3BP1对SVA复制的影响与应激颗粒的形成无关。综上,本研究获得1株G3BP1-/-293T细胞系,该细胞能够在病毒感染早期抑制SVA复制,为进一步研究G3BP1对SVA复制的影响奠定了基础。
- 高雁怩郭承意姜晓琳赵栩白娟
- 关键词:基因敲除293T细胞
- 一种基于CRISPR-Cas9系统敲除Twist1基因的293T细胞系方法及应用
- 本发明利用一种基于CRISPR‑Cas9编辑技术得到敲除人Twist1基因的细胞系,其原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了靶向人Twist1基因的sgRNA,然后将sgRNA克隆至带有Cas9基因的lentiCRIS...
- 刘薇马振玲岳岩磊张国只苏丽娟许君吴亚儒
- 基于PiggyBac转座系统构建稳定表达ABEmax基因的HEK293T细胞系
- 2022年
- 目的:使用PiggyBac(PB)转座系统在HEK293T细胞中敲入腺嘌呤碱基编辑工具ABEmax基因,构建稳定表达ABEmax基因的工具细胞系.方法:根据PB转座原理,将ABEmax基因和抗生素筛选基因以同源重组的方法插入到PB质粒内,构建pPB-ABEmax真核重组表达质粒.将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中,利用嘌呤霉素抗性筛选细胞,流式细胞仪分选单克隆细胞.单细胞扩增培养后,利用PCR鉴定ABEmax基因的插入水平,RT-qPCR鉴定ABEmax的表达水平以及利用sgRNA测试工具细胞的编辑水平.结果:成功构建pPB-ABEmax真核重组表达质粒,筛选出特异性插入ABEmax基因的HEK293T细胞系,HEK293T-ABEmax的基因编辑效率与HEK293T细胞转染Test-sgRNA与ABEmax的对照组无统计学差别(P>0.05).结论:利用PiggyBac基因编辑技术成功构建并获得了腺嘌呤碱基编辑工具ABEmax基因稳定表达细胞系.
- 张璐安莉莎金孝华马旭
- 关键词:细胞系
相关作者
- 沈佰华
- 作品数:91被引量:401H指数:11
- 供职机构:上海市免疫学研究所
- 研究主题:细胞凋亡 免疫抑制 CYR61 类风湿性关节炎 类风湿关节炎
- 张冬青
- 作品数:202被引量:949H指数:17
- 供职机构:上海交通大学医学院上海市免疫学研究所
- 研究主题:T细胞 树突状细胞 类风湿关节炎 类风湿性关节炎 免疫调节
- 周光炎
- 作品数:224被引量:882H指数:12
- 供职机构:上海交通大学医学院
- 研究主题:天花粉蛋白 免疫抑制 HLA MHC T细胞
- 张凤蕴
- 作品数:114被引量:282H指数:11
- 供职机构:哈尔滨医科大学附属第二医院
- 研究主题:胸腺内注射 EAE 实验性变态反应性脑脊髓炎 流行性出血热 免疫耐受
- 张飚
- 作品数:27被引量:102H指数:5
- 供职机构:青岛大学医学院附属医院
- 研究主题:皮肤移植 胸腺内注射 免疫耐受 异基因抗原 小鼠皮肤