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邱文
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- 所属机构:南京医科大学
- 所在地区:江苏省 南京市
- 研究方向:医药卫生
- 发文基金:国家自然科学基金
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- 目的:构建大鼠S100钙结合蛋白A8(S100A8)基因启动子荧光素酶报告质粒,并在HEK-293T中检查过表达性别决定区Y框蛋白7(SOX7)基因对S100A8启动子活性的影响,同时筛选可能的SOX7结合元件。方法:采用PCR技术扩增大鼠S100A8启动子全长,经双酶切后连接到pGL3-basic中,命名为pGL3-S100A8-FL。将pGL3-S100A8-FL与前期构建的pIRES2-SOX7质粒共转染HEK-293T,再测定荧光素酶活性。此外,运用JASPAR预测S100A8启动子区可能包含的SOX7结合元件,并依此构建4个启动子截短质粒(即pGL3-S100A8-1~4)。将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~4分别与pIRES2-SOX7共转染HEK-293T,检查荧光素酶活性。接着构建SOX7结合元件突变的S100A8启动子质粒(即pGL3-S100A8-M),与pIRES2-SOX7转染HEK-293T,检测其荧光素酶活性。结果:将pGL3-S100A8-FL与p IRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现过表达SOX7可显著增加pGL3-S100A8-FL启动子活性。将pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~4分别与p IRES2-SOX7共转染HEK-293T,发现pGL3-S100A8-4启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL和pGL3-S100A8-1~3,提示SOX7与S100A8启动子结合元件可能位于-200~+51 nt区域内。将-86~-57 nt元件突变质粒(pGL3-S100A8-M)或pGL3-S100A8-FL与pIRES2-SOX7共转HEK-293T,发现pGL3-S100A8-M启动子活性显著低于pGL3-S100A8-FL。提示SOX7可能与S100A8启动子-86~-57 nt元件结合。结论:成功构建大鼠S100A8基因启动子全长、截短和突变荧光素酶报告质粒,并初步确定S100A8启动子区的SOX7结合元件。
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- 目的:研究沉默血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1,TSP-1)基因对于亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物诱导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)增殖的影响。方法:设计合成针对TSP-1基因的发夹式siR-NA(small hair RNA,shRNA),并构建相应的表达质粒,将TSP-1 shRNA(shTSP-1)转染体外培养的大鼠GMC,再给予亚溶解型C5b-9刺激。以实时PCR和蛋白质印迹法检查各组GMC中TSP-1、细胞周期蛋白D2(cyclin D2)及增殖细胞核抗原(proliferative cell nuclear antigen,PCNA)的mRNA及蛋白表达情况。另用3H-胸腺嘧啶核苷酸掺入法(3H-thymi-dine incorporation,3H-TdR)和CCK-8(cell counting kit-8)方法分别检查GMC的DNA合成及细胞数量的改变。最后,观察各组GMC中α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达情况。结果:使用shTSP-1沉默TSP-1基因,对于亚溶解型C5b-9刺激GMC后18 h诱导的cyclin D2和PCNA表达及DNA合成均无显著影响,但是shTSP-1能够抑制亚溶解型C5b-9刺激GMC 54 h时细胞数量的增加,同时能下调由亚溶解型C5b-9刺激GMC引起的α-SMA表达。结论:用shTSP-1沉默GMC中的TSP-1基因,可抑制亚溶解型C5b-9刺激GMC的增殖和α-SMA的合成,shTSP-1对GMC增殖的影响可能与其下调α-SMA的表达有一定关系。
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