中国博士后科学基金(20070410688)
- 作品数：2 被引量：2H指数：1
- 相关作者：王洪海张鹭廖海印马国举王庆忠更多>>
- 相关机构：复旦大学齐齐哈尔大学更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 结核分枝杆菌Rv0859基因的克隆、表达、纯化及蛋白的亚细胞定位被引量：1
- 2009年
- 本研究体外克隆了结核分枝杆菌Rv0859基因,融合表达并纯化了Rv0859蛋白。首先提取H37Rv标准菌株中的基因组DNA,设计Rv0859基因两端的引物,以H37Rv基因组DNA为模板通过PCR方法扩增Rv0859基因。用HindIII和BamHⅠ两种限制性内切酶双切Rv0859基因,T4连接酶连接到pET30载体上,再转入大肠杆菌JF1125中,经过筛选鉴定后抽提质粒测序,得到重组正确载体,转化到表达宿主大肠杆菌BL21中。用IPTG进行诱导表达,通过聚丙酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及质谱鉴定重组表达蛋白。0.05mol/L浓度的IPTG37°C诱导4h重组蛋白的表达量最高。制备重组蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western-blotting分析蛋白的亚细胞定位。结果成功地构建原核表达载体pET30a-Rv0859,并获得47845D左右的大量表达的Rv0859蛋白,Western-blotting结果表明Rv0859蛋白主要定位于细胞膜中,微量存在于细胞壁中,为进一步的Rv0859蛋白功能研究奠定了一定的基础。
- 刘岩岩马国举廖海印张鹭王洪海
- 关键词：克隆纯化
- 结核分枝杆菌Rv2461c基因的克隆、表达、纯化及其抗原性的初步检测被引量：1
- 2008年
- 目的:探索结核分枝杆菌Rv2461c基因编码的clpP蛋白作为结核检测抗原的可行性。方法:克隆结核分枝杆菌clpP蛋白的编码基因Rv2461c,构建pET30a-Rv2461c重组质粒,并将其成功的转化到大肠杆菌JF1125克隆载体中,测序鉴定结果正确。将pET30a-Rv2461 c重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,表达纯化目的蛋白进行质谱分析.制备clpP蛋白的多克隆抗体,通过亚细胞分离及Western检测分析蛋白的亚细胞定位,纯化的clpP蛋白通过间接ELISA实验进行抗原性的初步检测。结果:结核分枝杆菌clpP蛋白大量存在于细胞质中,少量存在于细胞壁和细胞膜中。重组抗原在检测肺结核病人中的检出率为38.3%(23/60),检测敏感性为38.3%,特异性为90%。结论:为后续深入研究clpP蛋白的生物功能、clpP作为诊断靶标、药靶候选蛋白的可行性提供了基础。
- 王庆忠张鹭马国举廖海印王洪海
- 关键词：结核分枝杆菌蛋白表达亚细胞定位
