黑龙江省自然科学基金(D200980)
- 作品数：3 被引量：3H指数：1
- 相关作者：杨子超张惊宇赵虹赵虹徐万海更多>>
- 相关机构：哈尔滨医科大学附属第四医院哈尔滨医科大学更多>>
- 发文基金：黑龙江省自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定被引量：3
- 2010年
- 目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。
- 赵虹赵虹张惊宇徐万海杨子超
- 关键词：RNA干扰慢病毒载体LENTIVIRAL慢病毒表达载体胶质瘤发生阳性克隆
- 人脑组织中STUB1基因的克隆构建及表达
- 2010年
- 目的构建人STUB1基因全长cDNA的真核表达载体DNA3.1-STUB1,观察STUB1基因在人脑胶质瘤细胞(U251细胞)中的表达。方法 RT-PCR技术扩增获得人脑组织STUB1基因全长cDNA,将扩增的产物进行TA克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,将STUB1基因酶切后构成pcDNA3.1-STUB1的真核表达重组质粒。用脂质体将重组质粒转染入U251胶质瘤细胞系,48h以后通过Westernblotting实验观察重组质粒的表达情况。结果 RT-PCR扩增获得人脑组织中STUB1cDNA全长912bp,构建完成真核表达重组质粒pcDNA3.1-STUB1,经DNA测序与GenBank中的人STUB1cDNA序列一致。经neomycin(neo)筛选获得稳定表达重组质粒的单克隆细胞株后,经过Westernblotting显示转染重组质粒的细胞中有高水平的STUB1基因表达。结论成功构建了pcDNA3.1-STUB1真核表达质粒,并发现其在U251细胞中过量表达,为进一步研究STUB1基因在胶质瘤发生发展中的作用奠定了基础。
- 赵虹刘惠敏徐万海张惊宇杨子超赵庆杰
- 关键词：脑胶质瘤基因表达重组质粒
- 小鼠NMNAT1基因的过表达和RNAi重组慢病毒的构建包装和检测
- 2011年
- 目的:针对小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)基因构建质粒并进行慢病毒包装,同时检测其表达水平和干扰效率,为进一步探讨该基因的功能提供研究工具和实验基础。方法:根据NMNAT1基因信息,用慢病毒载体pLenti6构建三种重组质粒,分别包含NMNAT1 cDNA全长、一个针对NMNAT1的小干扰序列和一个用于干扰对照的阴性序列。把这些质粒包装进慢病毒载体,并检测病毒滴度,再用慢病毒感染Hela细胞检测NMNAT1表达量和RNA干扰效率。结果:测序结果证明目的序列正确地插入到载体内。通过qPCR方法鉴定慢病毒包装成功,病毒滴度均为2×108 TU/ml以上。表达NMNAT1的重组慢病毒感染Hela细胞,该细胞能够高水平表达NMNAT1蛋白,而携带RNAi序列的慢病毒能够显著抑制其表达,干扰效率在70%以上。结论:针对NMNAT1的过表达和RNAi重组慢病毒制备成功,为进一步研究NMNAT1基因的功能和用慢病毒进行基因治疗提供了良好的研究工具。
- 赵虹杨子超张惊宇
- 关键词：慢病毒属基因过表达
