国家自然科学基金(30972677)
- 作品数：8 被引量：21H指数：2
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- 转录因子Sp1上调前列腺癌细胞中CD59的表达(英文)
- 2010年
- 目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1对CD59表达的影响。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418 筛选建立稳定表达转染基因的细胞株,Western blotting 检测转染细胞中 Sp1 和 CD59 基因的表达,MTT 和染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用。结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体,转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的PC-3细胞Sp1及CD59基因蛋白水平降低,MTT和染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础。
- 梁岩高美华张蓓冯翠萍
- 关键词：CD59启动子RNA干扰
- CD59与CD3在T细胞活化信号转导中的协同作用被引量：2
- 2012年
- 目的前期构建的真核表达载体pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD3分子在T细胞活化信号转导中的相互作用,进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi;脂质体法将两种载体分别转染Jur-kat细胞,经G418筛选建立稳定转染细胞系;RT-PCR技术检测转染后CD59和CD3ζ在mRNA水平的表达抑制效果;采用噻唑蓝比色法检测转染前后各组Jurkat细胞的增殖效应,Western Blot技术检测各组细胞ZAP-70酪氨酸磷酸化的水平,激光共聚焦扫描显微镜检测各组细胞内Ca2+变化,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素2(IL-2)的变化。结果重组载体转染后RT-PCR结果表明,转染pSUPER-CD3ζRNAi和pSUPER-CD59RNAi质粒的细胞组CD3ζ分子和CD59分子的表达分别受到抑制。转染干扰质粒的细胞组细胞增殖能力、ZAP-70酪氨酸磷酸化水平、Ca2+浓度及IL-2水平均明显低于未转染组和空质粒组,差异有显著性(F=96.13～328.60,q=6.27～32.664,P<0.01)。结论 CD59和CD3在T细胞活化信号转导中具有协同作用。
- 王娟高美华张蓓
- 关键词：抗原CD59抗原CD3JURKAT细胞信号转导
- CD59-CD2对T细胞信号转导的作用被引量：10
- 2011年
- 目的将构建的CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体在Jurkat细胞中稳定表达,研究CD59与CD2分子在T细胞信号转导中的相互作用,探讨CD59向T细胞内传递信号的相关机制。方法酶切鉴定构建的pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体,脂质体法转染Jurkat细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,免疫酶法检测转染细胞表面CD59的表达,Western blot检测转染细胞中CD59蛋白的表达;用CD59单克隆抗体作用于各组Jurkat细胞,使用激光共聚焦显微镜检测细胞浆内的Ca2+,ELISA检测细胞上清中白介素2(IL-2)的变化,比较各组差异。结果经酶切鉴定证实携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒扩增成功;免疫酶法和Western blot证实CD59在转染细胞中稳定表达,且转染组L-Jurkat细胞比正常组Ju-rkat细胞CD59表达量增加,二者比较其差别有统计学意义(P<0.05);与正常细胞相比,胞浆内Ca2+和IL-2在转染细胞中均高表达,两组细胞比较其差别有统计学意义(P<0.05)。结论 pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达载体可在Jurkat细胞中稳定表达,CD59mAb交联刺激后,CD59可通过CD2向细胞内传递信号,引起细胞内信号分子的一系列变化,为研究CD59与CD2在T细胞信号转导中的协同作用及进一步探讨CD59向T细胞内传递信号的机制奠定基础。
- 高美华钟丹丹张蓓
- 关键词：CD59基因融合基因JURKAT细胞细胞信号转导
- RNA干扰沉默Spl基因抑制前列腺癌细胞中CD59的表达
- 2010年
- 目的采用RNA干扰技术沉默前列腺癌PC-3细胞转录因子Sp1的表达,观察其对CD59的表达影响。方法构建靶向人Spl基因的干扰载体(pSUPER-siSp1),脂质体介导转染PC-3细胞,荧光倒置显微镜下观察转染效率,RT-PCR及Western-blotting检测其对Sp1及CD59蛋白质水平的影响,流式细胞仪检测CD59的表达,MTT法检测CD59抗补体活性的变化。结果成功构建针对Spl的干扰载体,转染后能够有效抑制前列腺癌PC-3细胞中Sp1与CD59蛋白的表达,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT实验显示,下调Spl表达可显著抑制CD59抗补体活性。结论 Spl基因沉默能够抑制人前列腺癌CD59的表达,为前列腺癌基因治疗提供新的思路和手段。
- 高美华梁岩
- 关键词：CD59RNA干扰
- 人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2012年
- 目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。
- 高美华王娟张蓓王冰解西河
- 关键词：SHRNACD59逆转录病毒载体
- CD59真核表达载体的构建及其对Jurkat细胞增殖的影响被引量：2
- 2011年
- 目的构建pIRES-CD59融合基因真核表达载体,探讨重组CD59在Jurkat细胞增殖中的作用。方法 RT-PCR法选择性扩增编码CD59的基因片段,克隆入pIRES真核表达质粒。脂质体法将重组载体转染Jurkat细胞,通过G418筛选获得稳定表达CD59的细胞克隆,利用RT-PCR和Western blot检测细胞中CD59的表达,通过MTT法检测Jurkat细胞的增殖。结果经酶切和测序鉴定表明携带CD59基因的重组质粒构建成功,RT-PCR和Western blot结果显示转染Jurkat细胞的CD59基因高表达,MTT实验显示转染CD59重组质粒的Jurkat细胞增殖速度明显快于对照组(P<0.05)。结论 pIRES-CD59真核表达载体在转染细胞Jurkat中可高表达CD59分子,并可影响Jurkat细胞的增殖,为研究CD59的生物学作用奠定了基础。
- 钟丹丹高美华张蓓
- 关键词：CD59基因JURKAT细胞细胞增殖
- 转录因子Sp1在肿瘤细胞CD59表达调控中的作用被引量：2
- 2011年
- 目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1对CD59表达的影响。方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418筛选建立稳定表达转染基因的细胞株,RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Sp1和CD59基因的表达,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用。结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体,转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的PC-3细胞CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低。结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础。
- 梁岩高美华张蓓
- 关键词：CD59启动子RNA干扰
- CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统的构建被引量：6
- 2011年
- 目的 CD59和CD2都是重要的淋巴细胞膜表面分子,参与T细胞信号转导。文中构建CD59和CD2融合基因真核表达系统,探讨CD59向T细胞传递信号的机制及CD59与CD2的相互作用。方法在CD59基因和CD2基因间加入一段柔性链接头(linker)基因序列,构建CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。利用RT-PCR法从人T细胞白血病细胞系Jurkat细胞总RNA中扩增CD59和CD2基因,分别构建CD59-T和CD2-T重组克隆载体,经限制性核酸内切酶酶切后与pIRES质粒进行重组,构建pIRES-CD59-linker-CD2融合基因真核表达系统。结果测序证实CD59和CD2基因扩增成功;经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明携带CD59-linker-CD2融合基因的重组质粒构建成功。结论构建CD59-linker-CD2真核表达系统为在真核细胞中表达CD59与CD2并进一步探讨其在T细胞信号转导中的作用提供了实验材料。
- 钟丹丹高美华李伟伟张蓓
- 关键词：CD59基因融合基因
