江苏省自然科学基金(BK2006245)
- 作品数：12 被引量：48H指数：4
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- 人胰岛素样生长因子Ⅰ基因对兔关节软骨细胞的有效转染及表达被引量：3
- 2008年
- 目的研究人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因构建的真核表达载体质粒对兔关节软骨细胞的有效转染和表达。方法将hIGF-Ⅰ基因构建在pcDNA3.1质粒上,经FuGENE6介导转入兔关节软骨细胞;设未转hIGF-Ⅰ基因软骨细胞作对照。转染后第3天用RT-PCR技术检测hIGF-Ⅰ、Ⅱ型胶原和聚合素在mRNA水平的表达,用细胞爬片免疫组织化学和Westernblot测定hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果RT-PCR显示hIGF-Ⅰ在转染组中琼脂糖电泳318bp处见到相应的目的条带,而对照组未出现目的条带;Ⅱ型胶原和聚合素在转染和对照组中以β-actin为参照半定量检测分别增加到1.3倍和1.4倍(P<0.05)。免疫组织化学显示转染组细胞爬片有hIGF-Ⅰ表达的棕黄色颗粒,对照组胞浆中未见棕黄色颗粒,转染组胞浆中出现大量的Ⅱ型胶原棕黄色颗粒。Westernblot显示转染组细胞在7.6KDa标记处有hIGF-Ⅰ的蛋白条带出现对照组则没有。结论FuGENE6介导的重组hIGF-Ⅰ基因真核表达载体质粒可有效转染兔关节软骨细胞,在mRNA和蛋白水平上有效表达hIGF-Ⅰ及Ⅱ型胶原,表达的hIGF-Ⅰ能在mRNA水平上增加Ⅱ型胶原和聚合素的合成,保持软骨细胞表型的稳定。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：关节软骨细胞
- 利用周期性静水压在水力聚焦生物反应器中构建组织工程软骨被引量：2
- 2009年
- 目的探讨在水力聚焦生物反应器（HFB）中加载周期性静水压构建组织工程软骨。方法分离培养兔关节软骨细胞并接种到PLGA支架上，细胞支架复合物分为加载周期性静水压的实验组和不加压的对照组，加压组的条件为：频率0．1Hz，压力0～200kPa，每天加压8h，两组均在HFB生物反应器中培养2周，利用免疫组织化学、RT-PCR、生物化学等方法观察周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨的影响。结果免疫组织化学显示加压组的Ⅱ型胶原和甲苯胺蓝的染色面积明显大于对照组（P〈0001）。RT-PCR显示加压组的Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组（P〈0．001），但Ⅰ型胶原的表达低于对照组（P〈0.05）。生物化学定量检测显示加压组的总胶原和糖胺多糖（GAG）的含量显著高于对照组（P〈0．001）。结论周期性静水压对HFB生物反应器中构建的组织工程软骨具有显著的促进促进作用，并且稳定了软骨细胞的表型。
- 刘瑞平范卫民高共鸣张广成岳海涛马益民
- 不同持续时间的周期性压力对构建组织工程软骨的影响被引量：4
- 2009年
- 目的探讨在周期性压力条件下构建组织工程软骨每天加压的最佳持续时间。方法构建自行设计的生物反应器和往复式加压泵组成的“周期性压力场培养系统”，将体外培养的第二代乳兔关节软骨细胞接种到聚乳酸一聚羟基乙酸共聚物（PLGA）支架上，随机分成四组。第一、二、三组分别在每天持续时间为4、8、12h的周期性压力（强度0～200kPa，频率为0．1Hz）下培养，第四组（对照组）为不加压的静态培养，各组培养时间均为2周。2周后肉眼大体观察，HE染色组织学观察工程软骨细胞增殖及分布；甲苯胺蓝染色法观察硫酸糖氨多糖（GAG）的分泌及分布，并用1，9-二甲基亚甲蓝法定量检测GAG的含量；采用Ⅱ型胶原免疫组织化学法观察Ⅱ型胶原的分泌及分布，并用image—proplus图像分析系统对Ⅱ型胶原染色面积行半定量分析。结果在强度0～200kPa，频率为0．1Hz周期性压力作用下，8h组支架．细胞复合体体积最大，表面光滑、有光泽、有弹性，支架内软骨细胞数量最多，排列最为规则，Ⅱ胶原和GAG含量也最高（P〈0．01）。结论软骨细胞的新陈代谢受周期性压力持续时间的影响，在0～200kPa、0．1Hz频率作用下，每天持续8h的周期性压力能更好地促进软骨细胞增殖，合成Ⅱ型胶原、GAG等细胞外基质。
- 盛英俊范卫民马益民高峰高共鸣
- 关键词：软骨细胞
- 骨-关节软骨复合组织块构建的实验研究
- 2007年
- 目的探讨采用组织工程技术构建骨．关节软骨复合组织块的可行性。方法将分离、培养的第2代软骨细胞和成骨细胞分别接种于磷酸三钙支架上，培养2周后通过物理方法将两者连接成一个整体，然后接种于裸鼠皮下。术后8周取材，行组织学观察。结果复合组织块在体内分别形成软骨组织和成骨组织，而且两者界面整合良好。结论以软骨细胞和成骨细胞为种子细胞、以磷酸三钙为支架体外构建的组织工程软骨和骨，可在体内形成组织工程骨．关节软骨复合组织块，有望用于关节软骨缺损的修复。
- 范卫民崔维顶张广程
- 关键词：成骨细胞软骨
- 携带hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体构建
- 2009年
- 目的探讨构建携带hIGF-Ⅰ基因腺病毒载体的可行性。方法从pcDNA3.1-hIGF-Ⅰ质粒中克隆出hIGF-Ⅰ基因的编码序列,酶切、连接后,插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdshuttle-CMV,获得重组质粒pAdshuttle-CMV-hIGF-Ⅰ,将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183,进行同源重组,获得重组子pAdeasy-1-IGF-Ⅰ。鉴定后,将pAdeasy-1-IGF-Ⅰ转染人胚肾细胞(Ad293细胞),获得含hIGF-Ⅰ基因的重组腺病毒(rAd-hIGF-Ⅰ)。再鉴定后,Ad293细胞反复感染冻融扩增腺病毒,50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度。将病毒颗粒感染绿猴肾成纤维细胞(COS-7细胞),荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达,RT-PCR分析hIGF-Ⅰ基因在mRNA水平的表达,Western blot分析hIGF-Ⅰ在蛋白水平的表达。结果成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,转染COS-7细胞后发现绿色荧光蛋白表达,同时RT-PCR扩增出318 bp的目的条带,Western blot得到7.6kDa大小的目的蛋白,证明了腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ能成功转染COS-7细胞,hIGF-Ⅰ基因能在其中成功表达。结论成功构建出含有hIGF-Ⅰ基因的腺病毒载体rAd-hIGF-Ⅰ,并且证实其能对COS-7细胞进行有效转染,为组织工程软骨的进一步改良提供了高效的基因载体。
- 高共鸣范卫民刘瑞平卫积书马益民
- 关键词：腺病毒载体转染
- 应用旋转式生物反应器体外构建组织工程软骨具优越性被引量：2
- 2008年
- 目的:应用HFB-40型旋转式生物反应器体外培养一定形状的人工软骨组织,为组织工程软骨应用于更广泛的领域打下基础。方法:将第3代兔软骨细胞接种于2mm×4mm×4mm的长方体聚乳酸聚羟基乙酸聚合物(PLGA)上,随机分为A、B两组。A组为实验组,培养于生物反应器内;B组为对照组,培养于普通培养瓶内。4周后定量检测支架中氨基糖胺聚糖(GAG)、DNA含量,分析Ⅱ型胶原免疫组织化学染色面积百分比差异。结果:实验组支架-细胞复合体体积较大,较厚,表面光滑,有弹性,有光泽,其GAG、DNA含量以及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色面积百分比明显高于对照组(P<0.01)。结论:生物反应器相对于普通的培养瓶,能够提供更加有利于软骨细胞在PLGA中生长的外部环境,更有利于组织工程软骨的形成。
- 高峰范卫民崔维顶马益民朱长仁
- 关键词：生物反应器
- 壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种支架体外构建组织工程软骨的比较研究被引量：10
- 2007年
- 目的观察兔关节软骨细胞在壳聚糖、Ⅱ型胶原、聚羟基乙酸(PGA)三种细胞支架上的生长情况,探讨更适合构建工程软骨的细胞支架材料。方法多聚赖氨酸包埋壳聚糖、Ⅱ型胶原和PGA三种多孔海绵支架。将体外分离培养的兔关节软骨细胞种植于三种支架上。体外培养4周,对组织工程软骨进行大体标本观察和HE染色,检测软骨内DNA含量、Ⅱ型胶原和糖胺多糖(GAG)的分泌量。结果软骨细胞在壳聚糖支架内生长良好,培养4周后仍能维持软骨细胞的表型,其分泌Ⅱ型胶原和GAG的能力较其他两种支架好(P<0.01)。结论壳聚糖支架更适合软骨细胞的贴附生长,有利于维持软骨细胞的表型,是较好的软骨组织工程细胞支架。
- 欧阳彬范卫民马益民刘锋
- 关键词：软骨细胞细胞支架壳聚糖
- 兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的实验研究被引量：3
- 2007年
- 目的探讨兔骨髓间充质干细胞(MSCs)体外培养、定向诱导分化为成骨细胞的途径。方法抽取兔骨髓,以全骨髓贴壁培养法进行体外培养,贴壁细胞传代。取第3代细胞诱导培养,倒置显微镜下观察细胞形态。培养16d后,用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐(BCIP)/氯化硝基四氮唑蓝(NBT)底物显色试剂检测碱性磷酸酶(AP),茜素红染色检测钙结节。结果全骨髓贴壁培养法可获得MSCs,原代和传代培养的MSCs具有活跃的增殖能力。诱导培养后,AP检测与钙结节染色均为强阳性。结论兔骨髓中培养出的MSCs可以定向分化为成骨细胞,可用作骨组织工程中的种子细胞。
- 笪虎范卫民崔维顶高峰
- 关键词：间充质干细胞成骨细胞细胞培养骨组织工程
- 腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染对构建组织工程软骨的影响被引量：6
- 2009年
- 目的探讨腺病毒介导的人胰岛素样生长因子Ⅰ(hIGF-Ⅰ)基因转染对构建组织工程软骨的影响。方法分离新西兰大白兔关节软骨细胞,培养到第一代,用荧光标记的Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ转染,然后接种在PLGA支架上(转染组);未转染的软骨细胞接种在PLGA支架上(对照组),在体外培养2周。利用荧光显微镜、Western blot、RT-PCR、免疫组织化学等方法鉴定hIGF-Ⅰ基因的有效转染,并观察其对构建的组织工程软骨细胞外基质的影响。结果Ad/hrGFP-hIGF-Ⅰ能对兔关节软骨细胞进行有效转染,RT-PCR显示构建的组织工程软骨Ⅰ、Ⅱ型胶原、聚合素的表达高于对照组;定量检测显示胶原和GAG的含量高于对照组(P<0.01)。结论腺病毒介导的hIGF-Ⅰ基因转染能成功转染兔关节软骨细胞,用它构建组织工程软骨能显著促进软骨细胞外基质的合成。
- 刘瑞平范卫民高共鸣马益民
- 关键词：腺病毒软骨细胞
- 周期性压力对大鼠软骨细胞ERK1、ERK2的影响被引量：2
- 2010年
- 目的探讨周期性压力对大鼠软骨细胞细胞外信号调节激酶(ERK)1和ERK2的影响。方法将软骨细胞置于压力为150kPa,频率为0.1Hz的周期性应力系统中。分为四组:A组不加压作为对照;B、C和D组分别加压0.5、1和2h。用细胞免疫荧光法观察磷酸化ERK1和ERK2(pERK1和pERK2)在软骨细胞内的定位表达,同时用Westernblot法检测ERK1和ERK2在软骨细胞内的磷酸化。结果加压组的软骨细胞内pERK1和pERK2的荧光强度较A组明显增强;C组的荧光强度最大。pERK1和pERK2在B、C、D组内的表达较A组增高(P<0.01)。结论适当的压力刺激可导致软骨细胞内pERK1和pERK2表达增高,ERK1和ERK2可能在软骨细胞将压力信号转导为生物化学信号过程中起重要作用。
- 汤继磊殷国勇范卫民农鲁明任科伟
- 关键词：软骨细胞细胞外信号调节激酶
