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禽流感、新城疫可目视化诊断蛋白芯片的制备及初步应用被引量：14: 2009年; 本研究制备了可以同时鉴别诊断禽流感(AI)、新城疫(ND)2种禽病血清抗体的可视化蛋白芯片。以超速离心法和蔗糖密度梯度法分别纯化了2种病毒蛋白抗原,用点样缓冲液稀释后点于醛基修饰的片基上,制备蛋白芯片;将芯片与待检血清杂交后,再与胶体金标记的二抗杂交,银染显色后根据灰度值判定结果,从而建立了2种禽病的可视化蛋白芯片鉴别诊断方法。采用该方法对18份现地血清样品进行初步检测,结果显示该芯片可特异性的与相应的抗体杂交,无交叉反应,而且呈现较强的杂交信号,其信号灰度值在阳性血清浓度为50μg/mL～300μg/mL范围内成线性关系(Y=0.426X+4.225)。用该芯片方法和琼扩(AGP)抗体检测方法对18份现地样品进行符合率检测,结果表明该可视化蛋白芯片具有很好的特异性,并且检测灵敏度为是AGP方法的400倍以上。研究表明该方法可用于同步鉴别2种禽病,是一种有效的抗体检测新方法。; 石霖王秀荣杨忠苹陶启蒙王煜武嘉男蔡冬冬包红梅陈化兰; 关键词：禽流感新城疫可视化蛋白芯片

禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定被引量：4: 2006年; 目的:制备抗禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:分别用甲醛灭活的和TritonX100裂解的AIVH9N2及AIVNP基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠。经细胞融合、间接ELISA筛选及克隆化,建立能稳定分泌抗AIVNPmAb的杂交瘤细胞株。mAb的效价采用间接ELISA测定,用交叉反应试验及间接免疫荧光染色法检测mAb的特异性。结果:经细胞融合、筛选及克隆化,间接ELISA法测定,mAb共得到6株能稳定分泌抗禽流感病毒NPmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4F4、1C3、1G11、1C2、1D10及2E7。1G11、1D10腹水的ELISA效价最高,分别为2-13和2-14。交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明,两株mAb的特异性良好。结论:共获得6株抗AIVNP的mAb,其中2株mAb1C11和1D10的效价最高,特异性良好,为AIV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础。; 刘芳芳金梅林张安定但汉并陈焕春; 关键词：禽流感病毒单克隆抗体

H5亚型禽流感病毒HA1基因在Sf9昆虫细胞中的表达及其抗原性检测被引量：5: 2006年; 利用pBlueBacHis2杆状病毒载体在昆虫细胞Sf9中表达H5亚型禽流感病毒(AIV)的 HA1基因。Western-blotting证明HA1在昆虫细胞中得到了表达,其产物具有抗原性;且不与 H7、H9 AIV的抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性。Dot-ELISA结果显示,表达蛋白可以在非变性条件下与相应抗体作用,同样具有良好的抗原性。试验结果证明,表达的H5亚型AIV的 HA1蛋白,为检测禽类体内是否感染H5亚型AIV和监测免疫禽类血清H5抗体水平提供了优良的检测抗原。; 齐岩孙凌霜王彬孙进华王君伟师东方; 关键词：禽流感病毒 HA1基因杆状病毒真核表达

H5亚型AIVHA和HA1的Sf-9昆虫细胞表达及其作为检测抗原的初步比较分析: 2008年; 利用杆状病毒表达系统,在昆虫细胞Sf-9中分别表达了H5亚型禽流感病毒的HA、HA1。相同表达条件下,Western Blot分析比较表明,HA、HA1均与H5亚型AIV抗血清反应,且不与H7、H9亚型AIV抗血清发生交叉反应,具有良好的特异性;以Western Blot检测鸡、鸭AIV抗血清,初步表明,重组杆状病毒表达的HA、HA1均可作为H5亚型AIV血清检测的抗原,HA优于HA1。; 齐岩孙凌霜张贺楠王彬曲哲会史楠师东方王君伟; 关键词：禽流感病毒杆状病毒表达 HA HA1

在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型cDNA被引量：44: 2005年; 对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)、A/African　starling/983/79(H7N1)和　A/Turkey/Wisconsin/1/66(H9N2)。通过RT-PCR获得大约500　bp的禽流感病毒基因cDNAs片段,克隆,从重组质粒扩增DNA片段,并点到玻璃载体上,制成芯片。在病毒RNA反转录过程中,用Cy5标记样品　cDNAs。样品　cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型,依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点,杂交信号与预期设想基本一致。结果显示,DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。; 王秀荣邓国华于康震石锐刘丽玲乔传玲陈化兰孔宪刚; 关键词：H9亚型禽流感病毒 M基因 DNA芯片快速诊断技术 HA基因禽流感病毒 H5N1

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达: 2011年; 应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(H9N2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9。将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)进行诱导,产物处理后进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹和薄层扫描分析。结果发现HA蛋白可被大量表达,主要以包涵体形式存在,表达产物分子质量约64 ku,与理论推测值一致;菌液OD600值为1.0、IPTG终浓度为0.3 mmol.L-1、诱导时间4 h,其蛋白表达量最大,约占菌体蛋白总量的35%左右;通过免疫印迹试验发现,表达的蛋白可被禽流感H9亚型阳性血清特异性识别。研究结果表明,可以用原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,其产物具有免疫原性,可以用作禽流感抗体检测的免疫诊断试剂。; 石锐包红梅姜永萍乔传玲陈化兰王秀荣陈维多; 关键词：禽流感 H9 原核表达

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性被引量：3: 2007年; 从pMD18-T-HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒(AIV)HA1基因,并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A,将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1,与线性化杆状病毒DNA(Bac-N-BlueDNA)共转染sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经3次蚀斑纯化,得到重组杆状病毒rpBlueHisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示,HA1在昆虫细胞中得到表达,且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明,重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明,重组HA1蛋白具有良好的血凝性。; 贾珊珊孙凌霜齐岩孙进华姜亦飞王君伟; 关键词：禽流感病毒 HA1基因重组杆状病毒 H7亚型

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国家科技攻关计划(2004BA519A23)