国家自然科学基金(31000990)
- 作品数：16 被引量：31H指数：3
- 相关作者：王春生安铁洙朴善花李昊马丽媛更多>>
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- 小鼠MyoD基因真核表达载体的构建与检测被引量：1
- 2015年
- 为了最终建立诱导小鼠iP S细胞为成肌细胞的方法,试验在克隆小鼠Myo D基因的基础上,将其与pc DNA3.1载体连接,以构建真核表达载体;采用脂质体法将重组质粒转染到小鼠胚胎成纤维细胞中,利用Real-time PCR技术、免疫荧光检测和流式分析等技术对转染前后细胞的Myo D基因表达情况进行检测。结果表明:成功克隆获得Myo D基因,并构建真核表达载体Myo D-pc DNA3.1;转染Myo D-pc DNA3.1的小鼠胚胎成纤维细胞经免疫荧光检测后在荧光显微镜下呈现表达Myo D基因的红色;Real-time PCR检测其Myo D基因相对表达量提高至8.926±0.010;经BD Accuri-C6个人型流式细胞仪检测,约有93%的转染细胞表达Myo D蛋白,在荧光倒置显微镜下可观察到表达Myo D蛋白而呈现的绿色荧光。说明已成功构建特异表达Myo D基因的真核表达载体Myo D-pc DNA3.1。
- 马丽媛王春生杜文敬朴善花安铁洙
- 关键词：小鼠成肌细胞转染成纤维细胞表达量
- 绵羊Pax7基因慢病毒示踪载体的构建与表达检测被引量：3
- 2020年
- 为了探讨是否可以利用Pax7基因诱导绵羊间充质细胞为成肌细胞,试验采用RT-PCR技术从绵羊肌肉中成功克隆Pax7基因的编码区序列(CDS)后,将其连接到酶切后的空表达载体pTetOn3-DsRed上,构建诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7。通过脂质体法将诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7与辅助包装载体VSV-G、px和pMD共转染到293T细胞中,获得病毒上清液后侵染293T细胞,利用Western-blot技术检测侵染后细胞中Pax7基因的表达情况,验证所构建载体的有效性及Pax7基因的表达活性。结果表明:试验成功克隆得到绵羊Pax7基因的CDS及构建出诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7;病毒侵染后,靶细胞经绿光(532 nm)照射可表达红色荧光;与空白对照细胞中Pax7基因的表达量相比,侵染诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7的293T细胞中Pax7基因的表达量明显上升,且加入诱导物强力霉素后Pax7基因表达量显著高于未添加强力霉素的细胞。说明试验已成功构建出特异性表达绵羊Pax7基因的诱导型慢病毒示踪载体pTetOn3-DsRed-Pax7。
- 孙多临冯汉卿赵恒陈胜男李松美王春生
- 关键词：绵羊慢病毒载体
- MSTN基因敲低绵羊成纤维细胞株的筛选被引量：1
- 2014年
- 为了获得绵羊MSTN基因敲低成纤维细胞株,克隆获得MSTN基因序列构建其真核表达载体;设计合成并筛选3种MSTN基因干涉序列(M1、M2和M3),构建相应的3种RNA干涉载体;将MSTN基因真核表达载体单独或分别与3种RNA干涉载体共转染绵羊成纤维细胞后,分别检测其对MSTN基因表达的干涉效率以获得最佳的MSTN基因RNA干涉载体;将筛选的RNA干涉载体线性化后转染绵羊成纤维细胞,通过筛选获得转基因细胞株。结果显示,成功克隆得到与GenBank中序列同源性为100%的绵羊MSTN基因序列,并获得真核表达载体pcDNA3.1(+)-MSTN;构建获得MSTN基因RNA干涉载体pRNAT-M1、pRNAT-M2和pRNAT-M3;与单独转染pcDNA3.1(+)-MSTN后293GP细胞中MSTN基因的相对表达量相比,转染干涉载体后MSTN基因相对表达量明显下降,其中pRNAT-M1干涉效率最佳;将pRNAT-M1线性化后转染绵羊成纤维细胞并利用G418筛选获得转基因阳性细胞;获得的转基因阳性细胞的细胞形态、生物学特性均呈现正常;PCR检测结果显示,pRNAT-M1已整合到细胞基因组中。上述结果表明,成功获得了MSTN基因敲低的绵羊成纤维细胞株。
- 李昊薛超张秋婷王春生朴善花宋红卫安铁洙
- 关键词：绵羊成纤维细胞MSTN基因RNA干涉转基因细胞
- 绵羊Oct4基因的克隆及序列分析被引量：2
- 2019年
- 为了克隆出绵羊的Oct4基因的编码区序列,研究利用RT-PCR技术,根据GenBank中小鼠、人,猪、牛等的Oct4基因编码区序列设计出特异性引物,从绵羊囊胚中扩增绵羊Oct4编码区序列并进行测序,分析。结果表明,绵羊Oct4基因的编码区长度为1083bp,其中包括终止密码子,可以编码360个氨基酸。绵羊Oct4基因CDS区的核苷酸序列与牛、猫、人、恒河猴、小鼠、兔、大鼠和猪等物种相似,比较相应序列,同源性分别为97.8%、91.1%、89.1%、89.0%、82.3%、85.7%、83.2%和94.7%;比较其氨基酸序列,同源性分别为98.3%、93.1%、91.4%、91.1%、83.8%、85.7%和97.2%;使用生物信息学软件分析结果表明,绵羊Oct4基因含有两个POU特异结构域和1个HOMEOBOX-1结构域。本研究为进一步探索Oct4基因的功能及探讨其在绵羊体细胞重编程的过程中的作用奠定了基础。
- 田丽时邵辉胡虹宇陈胜男李松美王春生
- 关键词：绵羊基因克隆
- 绵羊Nanog启动子克隆及其表达活性的检测
- 2017年
- 通过比对人、鼠、兔和牛的Nanog启动子保守区设计引物,PCR扩增绵羊Nanog基因启动子序列并分析其调控位点。将其连接到去掉自身CMV启动子的pAcGFP1-N1载体上,构建一个由Nanog启动子带动的真核表达载体(SNanog-pAcGFP1-N1),即构建一个能由该启动子序列带动并产生绿色荧光蛋白(GFP)的真核表达载体,并用脂质体法转染入终末分化细胞(小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞)、胚胎干细胞和小鼠胚胎,检测其表达活性。结果显示:成功克隆出1 836bp Nanog启动子序列,通过分析发现该序列含有SP1结合位点、CAAT框、TATA框等功能区;当转染SNanog-pAcGFP1-N1重组质粒后,小鼠胚胎和小鼠胚胎干细胞中能检测到绿色荧光,且在转染72h后达到最大荧光强度,而在小鼠成纤维细胞和绵羊成纤维细胞中不能观察到GFP。结果表明:本试验成功克隆获得绵羊Nanog启动子,所构建的真核表达载体具有在多能干细胞中特异性表达活性。
- 郭虎章栩铖胡媛绣珠尚美奇安铁洙王春生
- 关键词：绵羊
- 小鼠L-Myc基因逆转录病毒载体的构建与检测
- 随着对诱导多能干细胞(iPS细胞)的深入研究,如何优化诱导条件、诱导效率以及避免其癌变成为了关键。已有研究表明,在培育iPS细胞的时候,使用基因'L—Myc'代替基因'c—Myc',可大幅降低iPS细胞癌变的风险,从而有...
- 王子竹王春生张志人朴善花安铁洙
- 关键词：诱导多能干细胞逆转录病毒
- 文献传递
- 哺乳动物DNA甲基化及其在体细胞诱导重编程中的作用被引量：3
- 2014年
- 诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPS)技术提供了将终末分化的细胞逆转为多潜能干细胞的可能,在干细胞基础理论研究和再生医学中具有重要意义。然而,目前体细胞诱导重编程方法效率极低,常发生不完全的重编程。研究表明,在不完全重编程的细胞中存在体细胞的表观遗传记忆,而DNA甲基化作为相对长期和稳定的表观遗传修饰,是影响重编程效率和iPS细胞分化能力的重要因素之一。哺乳动物DNA甲基化是指胞嘧啶第五位碳原子上的甲基化修饰,常发生于CpG位点。DNA甲基化能够调节体细胞特异基因和多能性基因的表达,因此其在哺乳动物基因调控、胚胎发育和细胞重编程过程中发挥着重要作用。此外,异常DNA甲基化可能导致iPS细胞基因印记的异常和X染色体的失活。文章重点围绕DNA甲基化的机制、分布特点、及其在体细胞诱导重编程中的作用进行了综述。
- 宋红卫安铁洙朴善花王春生
- 关键词：DNA甲基化诱导多能干细胞体细胞重编程
- 小鼠miR367逆转录病毒载体的构建与检测被引量：1
- 2013年
- 为了探明小鼠体细胞重编程过程中miR367的作用机制,试验构建小鼠miR367逆转录病毒载体。根据NCBI上小鼠miR367的相关序列,从小鼠基因组中扩增miR367并将其连接到pMD18-T载体,然后对重组质粒进行双酶切并回收目的片段。将目的片段与pMXs逆转录病毒载体连接,然后依次经过酶切、PCR筛选阳性克隆和测序,最终构建逆转录病毒载体miR367-pMXs;采用磷酸钙法将miR367-pMXs转染plat-E细胞,以包装逆转录病毒颗粒;用逆转录病毒颗粒侵染小鼠胚胎成纤维细胞,在侵染后的第5天,提取被侵染细胞的总RNA,逆转录后获得cDNA,并采用Q-PCR方法检测侵染细胞中的miR367表达量。结果表明,被逆转录病毒侵染后,小鼠胚胎成纤维细胞中miR367的相对表达量比侵染前约提高了170倍。上述结果表明,成功构建小鼠miR367的逆转录病毒载体,为开展体细胞重编程机制的相关研究提供依据。
- 张志人安铁洙王子竹朴善花王春生
- 关键词：细胞重编程MICRORNA逆转录病毒载体
- 山羊c-Myc基因的克隆及序列分析被引量：2
- 2014年
- 为了克隆出山羊c-Myc基因的CDS区序列,本研究利用RT-PCR技术,参照GenBank报道的绵羊、牛、猪、马等的c-Myc基因CDS区序列设计出特异性引物,从山羊胚胎皮肤组织中扩增出山羊c-Myc CDS区序列并进行序列分析。结果表明,山羊c-Myc基因CDS区全长1320bp(包括终止密码子),与绵羊c-Myc基因核苷酸序列(GenBank登录号:Z68501.1)比对仅有10处存在差异,其核苷酸序列同源性为99.17%,推导的氨基酸序列同源性为99.09%;与其他物种进行同源性分析结果显示,山羊c-Myc基因CDS区与猪、狼、人、大鼠、小鼠的核苷酸序列同源性分别为91.2%、92.0%、90.2%、86.9%、86.0%,推导的氨基酸序列同源性分别为93.6%、96.1%、92.3%、91.1%、89.6%;生物信息学软件分析结果表明,山羊c-Myc蛋白产物定位于细胞核并含有HLH结构域。本研究为进一步了解c-Myc基因的功能及探讨其在山羊体细胞重编程过程中的作用奠定了基础。
- 安辰瑞安铁洙张秋婷李昊朴善花王春生
- 关键词：C-MYC基因基因克隆
- microRNAs在多能干细胞向心肌细胞分化中的作用被引量：8
- 2015年
- microRNAs(miRNAs)是长约22 nt的非编码RNAs,广泛参与细胞的增殖、分化、病变、修复和凋亡等多种生命活动.多能干细胞(pluripotent stem cells)是指体外具有自我更新和多向分化潜能的细胞,在一定条件下可被定向诱导分化为多种细胞类型.miRNAs在多能干细胞中表达丰富,并通过调控基因表达影响其自我更新及分化.由多能干细胞向心肌细胞分化的方法主要有3种,即拟胚体形成法、与内胚层细胞共培养法和特定诱导物添加法.虽然这3种方法均可成功诱导多能干细胞向心肌细胞分化,但重复率很低.所以,人们把研究的视野逐渐转向miRNAs——这个广泛参与细胞生命活动的小分子物质.大量研究表明,在多能干细胞中,不同的miRNAs可通过打靶不同基因影响其向心肌细胞分化.在间充质干细胞中,miR-1、miR-133和miR-499可分别打靶Hes-1、SRF和Pdcd4;而在胚胎干细胞中,miR-1和miR-499分别打靶Hand2和Pacs2促进其向心肌细胞分化.miRNAs在多能干细胞向心肌分化作用机制的研究必将促进再生医学在心脏疾病治疗上的应用.
- 宋维文安铁洙王春生
- 关键词：MIRNA多能干细胞心肌细胞
