国家自然科学基金(30370682)
- 作品数：14 被引量：17H指数：3
- 相关作者：陆凤先朱云娟黄丽娟李兰英赵紫琴更多>>
- 相关机构：天津医科大学天津医科大学代谢病医院天津市公安医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 实时定量RT-PCR方法检测豚鼠TSHR免疫BALB/c小鼠甲状腺TSHR的表达被引量：1
- 2005年
- 目的:建立外标准法SYBRGREENI实时定量(real-time)RT-PCR方法,以检测豚鼠TSHR分子免疫对BALB/c小鼠甲状腺TSHRmRNA的表达的影响。方法:取正常BALB/c小鼠甲状腺提取甲状腺总RNA,逆转录后进行PCR,得到333bp扩增产物。经回收纯化后作为real-timePCR的标准品,稀释为106、105、104、103、102、101拷贝,制作标准曲线;并同时进行普通PCR,比较其灵敏度。优化反应条件使溶解曲线有特异扩增。检测豚鼠TSHR分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺TSHRmRNA的表达。结果:建立的外标准法SYBRGREENI实时定量RT-PCR方法可以灵敏的检测到10copy的核酸,灵敏度为普通PCR的104倍;溶解曲线只有特异峰,溶解温度为82.9℃。没有明显的引物二聚体和非特异峰出现。不同标准点批间变异系数范围为5.8%￣14.3%(n=6)。与对照组比较,TSHR大分子免疫的BALB/c小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平显著升高(P<0.05)。结论:外标准法SYBRGREENI实时定量RT-PCR具有灵敏度高,特异性强,重复性好的特点,比普通PCR更精确地检测出小鼠甲状腺组织TSHRmRNA的水平。
- 朱云娟黄丽娟陈宁沈炳玲陆凤先
- 关键词：TSHRMRNASYBR
- hTSHR胞膜外区片段真核表达载体的构建和表达
- 2008年
- 目的：构建人类促甲状腺激素受体（hTSHR）胞膜外区氨基端的两个片段hTSHRf（aa29-100）、hTSHRe（aa101-278）的真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hT-SHRe,并在CHO细胞中进行表达。方法：RT-PCR法从人甲状腺正常组织的cDNA中扩增hTSHRf和hTSHRe,定向插入真核表达载体pcDNA3.1（D）/V5-His-TOPO中,经酶切、PCR和测序鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行表达,RT-PCR扩增转染细胞的cDNA、Western blot分别鉴定hTSHR在CHO细胞中mRNA和蛋白水平的表达。结果：RT-PCR分别扩增两个片段的阳性克隆株,所得片段大小与预期一致,经Western blot鉴定,相对分子质量（Mr）分别为11900、23600左右,与预期的大小相符。结论：真核表达载体pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe构建成功,RT-PCR和Western blot检测证实重组质粒能在CHO细胞中高效表达,为进一步研究pcDNA3.1-hTSHRf和pcDNA3.1-hTSHRe在体内的基因表达,建立Graves＇病的动物模型奠定了基础。
- 赵紫琴李兰英陆凤先朱学良朱云娟
- 关键词：TSH受体真核表达
- hTSHR188-403bp基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型被引量：3
- 2008年
- 目的:构建pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp)重组质粒,并将其基因免疫BALB/c小鼠建立Graves’病动物模型。方法:RT-PCR扩增hTSHR膜外区188～403bp,与pcDNA3.1载体连接,构建重组质粒pcDNA3.1/hTSHR,用酶切、PCR及测序方法进行鉴定。于1、4、7、9、10周将重组体免疫实验组小鼠,对照组注射生理盐水,0、6、11周取血,检测血清TRAb、T4、TSAb、TBAb。取甲状腺常规病理切片,HE染色镜检。结果:构建的重组质粒经酶切、PCR鉴定证明插入方向正确,测序结果与GeneBank中hTSHR的相应片段序列相同。免疫组T4、TRAb和TSAb水平均从第6周开始显著升高(P<0.05),TBAb差异无统计学意义(P>0.05),对照组差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组甲状腺病理检查结果,显示滤泡增生,胶质浓缩等Graves’病的病理表现,对照组形态正常。结论:构建了重组质粒pcDNA3.1/hTSHR(188～403bp),成功建立了类Graves’病动物模型。
- 赵紫琴李兰英朱云娟
- 关键词：基因免疫PCDNA3.1TSH受体动物模型
- TSHR大分子及其活性多肽在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究被引量：2
- 2006年
- 目的:观察促甲状腺激素受体(TSHR)及其活性片段aa352-366在BALB/c小鼠体内的免疫原特性研究,探讨TSHR分子结构与功能的关系。方法:将血蓝蛋白(KLH)偶联的多肽TSHRaa352-366-KLH和多肽加受体混合组-TSHRaa352-366-KLH加豚鼠TSHR(gTSHR),间隔15d分两组分别注入BALB/c小鼠腹腔内,对照组注射KLH,测定各时相血清中甲状腺激素及促甲状腺激素受体抗体水平;90d后处死动物,检测小鼠甲状腺组织TSHRmRNA水平及其病理变化。结果:与各组自身0d的数据比较,多肽组小鼠血清TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb升高(P<0·01);多肽加受体混合组TT3、TT4水平降低(P<0·01),TRAb(P<0·01)、TBAb(P<0·05)和TSAb(P<0·05)均升高。此外,混合组甲状腺组织TSHR mRNA水平明显高于正常组(P<0·05);多肽组小鼠甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩及胶质浓缩等甲减的病理改变,而混合组则呈现不均一的病理变化。结论:TSHR以及活性片段hTSHRaa352-366都具有免疫原性,刺激小鼠血清TRAb、TSAb和TBAb的产生,引起甲状腺组织的病理改变。
- 朱云娟陈宁黄丽娟姚小梅沈炳玲叶静戴玉杰刘欣张丽莙李兰英陆凤先
- 关键词：肽碎片
- 实时荧光定量聚合酶链反应技术及应用被引量：6
- 2006年
- 赵紫琴陆凤先
- 关键词：RQ-PCRSYBRCHAIN
- pcDNA3.1/hTSHR_(1043～1354 bp)重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
- 2007年
- 目的构建重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp及在中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达hTSHR膜外区氨基酸314～418蛋白分子。方法提取人正常甲状腺组织总RNA,反转录后进行聚合酶链反应(PCR),将纯化的扩增产物hTSHR1043～1354bp与表达载体pcDNA3.1连接后转化TOP10E.coli感受态菌。经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定插入序列和方向正确的重组质粒转染CHO细胞,并用Westernblot方法鉴定表达的蛋白。结果PCR扩增得到hTSHR膜外区C端312bp的基因片段hTSHR1043～1354bp。该片段与表达载体pcDNA3.1的连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHR1043～1354bp片段插入序列和方向正确。重组质粒转染的CHO细胞裂解液经Westernblot可以检测出15900的蛋白条带,与预期的蛋白相对分子质量相符。结论成功构建了重组体pcDNA3.1/hTSHR1043～1354bp,其转染CHO细胞后表达159000的目的蛋白(hTSHR氨基酸314～418蛋白片段)。
- 朱云娟赵紫琴李兰英陆凤先姚智
- 关键词：甲状腺炎自身免疫性PCDNA3.1
- TSHR及活性多肽对BALB/c小鼠甲状腺的影响
- 2007年
- 目的:探讨促甲状腺激素受体(TSHR)及活性多肽对BALB/c小鼠甲状腺的影响。方法:对BALB/c小鼠腹腔注射血蓝蛋白耦联的人TSHR(hTSHRaa352～366)和从豚鼠脂肪细胞提取的TSHR(gTSHR)进行免疫,每2周免疫1次共6次,每次免疫前2d取血,检测血清T4、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)水平。12周后处死小鼠,取甲状腺做病理组织学检查。结果:血清T4水平hTSHRaa352～366组从第6周开始下降(P<0.01),而且一直维持到12周,血清TRAb水平明显升高(P<0.01),甲状腺组织显示滤泡上皮细胞扁平、核缺失、皱缩、胶质浓缩等甲状腺功能减退病理改变;gTSHR组血清T4水平在第6周已下降,而12周时有的下降、有的则升高,无统计学意义,血清TRAb水平升高(P<0.01),甲状腺组织出现不均一的病理表现。结论:hTSHRaa352～366刺激BALB/c小鼠产生TRAb和促甲状腺激素受体抑制抗体(TBAb),抑制促甲状腺激素(TSH)与TSHR结合,降低了甲状腺激素T4水平;而gTSHR刺激BALB/c小鼠同时产生TRAb、促甲状腺激素受体刺激抗体(TSAb)和TBAb,引起甲状腺功能亢进或甲状腺功能减退。
- 沈炳玲黄丽娟朱云娟朱学良陆凤仙
- 关键词：小鼠
- TSHR胞外区中间段在BALB/c小鼠体内的免疫原性研究
- 2007年
- 目的观察促甲状腺激素受体(TSHR)胞外区中间段(TSHRm)的免疫调节作用,探讨TSHR分子结构与功能的关系。方法将血蓝蛋白与原核表达的人TSHRm融合蛋白耦联,间隔15d注入BALB/c小鼠腹腔内共5次,对照组注射生理盐水;检测动物血清T_4、促甲状腺激素受体抗体(TRAb)、促甲状腺激素受体刺激抗体(TSAb)、促甲状腺激素受体阻滞抗体(TBAb)水平及甲状腺组织病理变化。结果对照组动物T_4水平升高后下降,TRAb水平较实验前升高,TSAb、TBAb无显著变化。实验组动物T_4总体水平一直保持升高趋势;免疫30 d时血清TRAb水平显著升高(P<0.001),TSAb、TBAb水平变化表现为先升后降。甲状腺组织的病理变化为甲状腺上皮细胞增生和淋巴细胞浸润。结论人TSHRm融合蛋白可刺激小鼠产生TRAb、TSAb和TBAb,其对动物机体的影响反映了TSAb和TBAb综合作用的结果,表明TSHRm可能具有TSAb及TBAb两种抗原表位。
- 陈宁朱云娟陈慧黄丽娟方佩华陆凤先
- 关键词：促甲状腺激素受体促甲状腺激素受体抗体自身免疫性甲状腺疾病
- 格雷夫斯眼病发病机制和治疗的研究进展
- 2005年
- 黄丽娟陆凤先
- 关键词：特异性自身免疫性疾病格雷夫斯进行性发展细胞激活
- pcDNA3.1/hTSHRa重组体的构建被引量：1
- 2006年
- 目的:构建重组体pcDNA3.1/hTSHRa。方法:提取人正常甲状腺组织总RNA,逆转录后进行PCR,将纯化的扩增产物hTSHRa与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法进行鉴定。结果:PCR扩增得到hTSHR膜外区N端753bp的基因片段hTSHRa。该片段与表达载体pcDNA3.1TOPO连接后转化TOP10E.coli感受态菌。重组质粒经PCR、HindⅢ酶切和核苷酸序列测定方法鉴定证实hTSHRa片段插入序列和方向正确。结论:hTSHRa片段插入真核表达载体pcDNA3.1TOPO,插入序列和插入方向正确,可用于后续基因表达。
- 朱云娟姚智赵紫琴李兰英陆凤先叶静
- 关键词：促甲状腺激素受体基因表达PCDNA3.1
