国家自然科学基金(31070093)
- 作品数：22 被引量：22H指数：2
- 相关作者：洪文荣温淑平石贤爱林强肖剑萍更多>>
- 相关机构：福州大学厦门三维丝环保股份有限公司常州方圆制药有限公司更多>>
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- 相关领域：生物学轻工技术与工程化学工程医药卫生更多>>
- 一株主产庆大霉素C2a工程菌的构建
- 2016年
- 为更好生产单组分庆大霉素C2a,拟构建一株主产庆大霉素C2a的工程菌.通过序列比对分析,锁定genB2为构建该工程菌的关键基因.以绛红小单孢菌G1008基因组为模板,PCR扩增genB2的上下游序列为同源交换臂,构建同源重组质粒pZB303.通过接合转移,将质粒pZB303导入绛红小单孢菌G1008,安普抗性及PCR扩增筛选得到一株genB2框内缺失工程菌GB102.发酵并提取代谢产物,再经TLC,HPLC,MS分析.结果表明,工程菌GB102主要积累庆大霉素C2a.有望用于生产单组分庆大霉素C2a.
- 林强陈洲琴阙新桥洪文荣
- 西索米星生物合成基因sis I功能的研究被引量：1
- 2016年
- 通过生物学试验,构建依纽小单孢菌TS388(Micromonospora inyoensis TS388)中sisI基因缺失工程菌,再通过分析其次级代谢产物的变化,揭示西索米星生物合成基因簇上sisI基因的功能.首先构建用于sisI基因框内敲除的穿梭载体pKTI3,经接合转移导入依纽小单孢菌TS388中,通过影印筛选及PCR鉴定获得sisI功能缺失工程菌TI1102(△sisI).工程菌经发酵,提取代谢产物,再经TLC及MS分析,用以比较亲株与工程菌代谢产物结构的差异.结果显示:工程菌TI1102代谢产物结构发生变化,不再合成西索米星,主要积累中间代谢产物JI-20A,由此证明了sisI基因参与了JI-20A到西索米星的3′,4′-双脱羟基作用.获得主产JI-20A的工程菌为该类半合成药物提供了重要前导化合物.
- 万云凤洪文荣石贤爱
- 关键词：生物合成
- aprK基因敲除的氨甲酰妥布霉素工程菌的构建被引量：2
- 2013年
- 以温敏型穿梭质粒pKC1139为基础,克隆安普霉素辛二糖合成酶基因aprK上下游序列作为同源交换臂,构建用于敲除aprK的重组质粒pBK5。pBK5转化E.coli ET12567后经接合转移导入黑暗链霉菌Tt-49,得到单交换菌株ST315。ST315经松弛传代后通过影印培养与PCR筛选得到aprK阻断突变株ST316。ST316发酵效价约1 500 ug/mL,发酵产物经TLC分析,发现安普霉素的生物合成被阻断,得到了一株主要产氨甲酰妥布霉素的工程菌。
- 李辉温淑平洪文荣
- 关键词：黑暗链霉菌安普霉素基因工程
- 黑暗链霉菌aprF-G基因功能的研究被引量：1
- 2012年
- 以研究黑暗链霉菌Tt-49中生物合成基因aprF-G生理功能为目标,利用接合转移法,将同源重组质粒pFD10导入黑暗链霉菌Tt-49,最终获得同源双交换菌株Tt-49G53,并对其生理特性进行考察。结果显示:其生长速度明显比亲株慢,产抗水平比亲株低100倍,仅为13U/mL。采用薄层层析法对其代谢产物进行分析,未检测到安普霉素。
- 朱碧银洪文荣李辉
- 关键词：黑暗链霉菌基因重组
- 单组分妥布霉素工程菌的构建被引量：2
- 2014年
- 目的阻断黑暗链霉菌中安普霉素和氨甲酰妥布霉素的合成,构建主产妥布霉素工程菌。方法以安普霉素生物合成基因apr J为靶标,克隆其上下游序列作为同源交换臂,构建重组质粒p XJ401,利用接合转移技术将其导入黑暗链霉菌Tt-49,获得工程菌TX302,并在此基础上敲除氨甲酰基转移酶基因tob Z,获得工程菌TX308。采用MS法,检测工程菌次级代谢产物的变化。结果 TX302主产氨甲酰妥布霉素,未检测到安普霉素。TX308不再合成氨甲酰妥布霉素,产物只检测到妥布霉素。结论磷酸变位酶基因apr J是安普霉素生物合成的关键基因,敲除后能有效阻断安普霉素的合成,工程菌TX308大量积累妥布霉素,不再合成安普霉素和氨甲酰妥布霉素,具有重要的产业化价值。
- 肖剑萍温淑平洪文荣
- 关键词：黑暗链霉菌安普霉素妥布霉素工程菌
- 黑暗链霉菌tobS1-C基因缺失突变株的构建被引量：3
- 2012年
- 通过敲除妥布霉素生物合成基因tobS1-C,定向选育阿泊拉霉素高产菌株。PCR扩增tobS1-C基因上下游同源序列和红霉素抗性基因ermE,构建穿梭载体pSH6,利用接合转移法转化黑暗链霉菌Tt49,经同源重组,敲除tobS1-C两基因序列,共2 484 bp,获得框内删除突变株黑暗链霉菌T103(△tobS1C)。发酵验证表明突变株不再合成妥布霉素,只合成阿泊拉霉素。
- 林玉双洪文荣
- 关键词：黑暗链霉菌同源重组基因缺失
- 妥布霉素糖基转移酶基因tobM2的研究
- 2016年
- 为探索妥布霉素生物合成过程中糖基转移的作用,对糖基转移酶基因tobM2进行了阻断研究.以妥布霉素生物合成基因簇为模板,构建了同源重组质粒pMB4,通过接合转移将质粒pMB4导入黑暗链霉菌Tt-49,然后利用红霉素抗性筛选并经PCR验证,获得了一株基因tobM2被阻断的工程菌TW402.发酵及代谢产物分析结果表明:工程菌总效价略有下降,约为出发菌株的85%.TLC检测与质谱分析显示,工程菌TW402主产安普霉素,并积累中间产物尼泊拉胺.TobM2转化尼泊拉胺生成妥布霉素,tobM2基因的缺失阻断了妥布霉素的生物合成,获得一株主产安普霉素工程菌.
- 温淑平陈晖汪洋洪文荣
- 关键词：黑暗链霉菌妥布霉素基因阻断
- 庆大霉素生物合成基因簇中抗性基因gmrB及gmrA的功能研究被引量：1
- 2018年
- 目的研究绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea)G1008中抗性基因gmrB与gmrA功能,为阐明庆大霉素生物合成机制奠定基础。方法以红霉素抗性基因ermE分别置换gmrB和gmrA基因,构建突变株GerB102和GerA102。借助TLC和MS分析突变株代谢产物是否变化,同时检测突变株耐受自身代谢产物的能力是否发生变化。结果突变株GerB102代谢产物没有发生明显变化,仍主要积累庆大霉素C化合物,而GerA102代谢产物发生变化。庆大霉素耐受性试验结果显示,GerB102和G1008耐庆大霉素浓度达到6000U/m L以上,而GerA102不足50U/m L。结论 gmrB既非庆大霉素生物合成的关键基因,也非关键的抗性基因,而gmrA是庆大霉素抗性的关键基因。
- 万云凤连榕洪文荣石贤爱
- 关键词：庆大霉素基因工程
- 庆大霉素生物合成基因genN的研究
- 2015年
- 利用生物信息学方法分析庆大霉素生物合成特色基因gen N的功能,构建gen N缺失的基因工程菌。首先运用分子生物学技术构建同源重组质粒p FU604,其次重组质粒经接合转移导入绛红色小单孢菌M.purpurea GK1101。最后,基于同源重组机制,利用安普霉素抗性筛选及PCR鉴定,得到gen N基因缺失的工程菌(M.purpurea GKN-27)。结果显示:较岀发菌GK1101,基因工程菌GKN-27不再继续合成庆大霉素C1a和C2b,阻断庆大霉素生物合成代谢流,并积累分子量为497、524、523、503四种新的中间代谢物,新的中间代谢物将有望开发新型药物。同时,也表明gen N不是C-6'N甲基化酶编码基因。
- 张熠洪文荣潘成奇
- 关键词：庆大霉素基因敲除工程菌构建生物信息学
- 庆大霉素C-6'位氨甲基化修饰基因的研究
- 2015年
- 探索庆大霉素C-6'位氨甲基化修饰作用的基因。首先构建用于gen T基因缺失的同源重组质粒p FT104,利用接合转移导入绛红色小单孢菌G1008,筛选获得一株gen T基因缺失工程菌GT106(Δgen T)。其次构建用于GT106上gen N基因缺失的重组质粒p FTN203,通过接合转移导入GT106,筛选获得一株工程菌GTN205(Δgen T+gen N)。最后在gen K基因已经明确为C-6'位甲基化酶基因的基础上,在GTN205中敲除gen K基因,筛选获得到一株工程菌GTNK308(Δgen T+gen N+gen K)。工程菌发酵产物经质谱分析结果表明,与出发菌G1008相比,GT106组分未发生变化,而GTN205不再合成庆大霉素C1,产物主要积累在庆大霉素C1a和C2,GTNK308未检测到庆大霉素C2b。结果说明,gen N基因缺失阻断了庆大霉素C1与C2b的合成,表明gen N基因参与修饰绛红糖胺C-6'位氨甲基化,而gen T并不参与修饰绛红糖胺C-6'位氨甲基化。
- 胡育龙洪文荣
- 关键词：庆大霉素修饰
