国家自然科学基金(39900130)
- 作品数：22 被引量：125H指数：12
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- 丙型肝炎病毒包膜蛋白E2可溶性单链可变区抗体在大肠杆菌中的表达被引量：20
- 2001年
- 利用分子生物学技术 ,构建表达丙型肝炎病毒 (HCV)包膜蛋白E2的人源单链可变区抗体 (ScFv)的原核表达载体 ,并在大肠杆菌JM10 9中表达可溶性的HCV E2 ScFv。以重组的HCVE2蛋白为包被抗原 ,利用噬菌体抗体库的表面展示技术 ,筛选到含有HCV E2 ScFv基因的噬菌体克隆 ,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒 ,经Ncol/NotI酶切鉴定后 ,该ScFv基因由 75 0bp组成 ,将其亚克隆到pCANTAB5E载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,提取质粒进行DNA序列测定 ,符合ScFv的基因结构特点。IPTG诱导转化的大肠杆菌JM10 9,在其培养上清中获得了可溶性HCVE2单链可变区抗体的表达。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV E2 ScFv具有与重组HCVE2蛋白的反应活性和特异性 ,对转化的JM10 9大肠杆菌上清中表述的HCV E2 ScFv进行聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) ,证实表达的HCV E2 ScFv的分子量为 2 8kD。为应用HCV E2 ScFv进行肝组织免疫组织化学和细胞内免疫基因治疗研究奠定了基础。
- 成军施双双钟彦伟夏小兵王刚王琳刘妍陈菊梅
- 关键词：丙型肝炎病毒包膜蛋白单链可变区抗体大肠杆菌
- 乙肝病毒核心蛋白人源单链抗体在大肠杆菌中的表达被引量：13
- 2002年
- 目的获得可溶性的抗乙型肝炎病毒（HBV）核心蛋白（core ）的人源单链可变区抗体（ScFv），为得到纯度高、活力强的HBc-ScFv和进一步的抗HBV 治 疗奠定基础。方法采用噬菌体表面展示技术，以重组的HBV核心蛋白为包 被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附-洗脱-扩增”筛选过程，获得抗原 结 合活性较强的乙型肝炎核心蛋白人源单链可变区抗体ScFv 片段克隆，并对其进行DNA序列及 免疫活性测定。从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒转化大肠杆菌HB2151，IPTG诱导表达乙型 肝炎核心蛋白可溶性人源单链可变区抗体，ELISA和western blot检测其抗原结合特异性。 结果克隆了乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体基因；经DNA酶切和序列 分析表明，该抗体基因由771个碱基组成；ELISA 和western blot结果表明：在大肠杆菌HB2 151中经IPTG诱导表达的可溶性乙型肝炎核心蛋白的单链可变区抗体，具有结合乙型肝炎核 心蛋白的特异性和免疫活性。结论克隆、鉴定并在大肠杆菌HB2151中表 达了可溶性的HBc-ScFv。
- 钟彦伟成军王刚陈新华李克李莉陈菊梅
- 关键词：单链可变区抗体可溶性表达大肠杆菌
- 丙型肝炎病毒核心蛋白人源单链可变区抗体的筛选与鉴定被引量：19
- 2001年
- 目的筛选、鉴定抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心蛋白的人源单链可变区抗体（ＳｃＦｖ）。方法采用噬菌体表面展示技术，以重组的ＨＣＶ核心蛋白为包被抗原，从噬菌体单链可变区抗体库中经过３轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原结合活性较强的ＨＣＶ核心蛋白特异性人源单链可变区抗体片段阳性克隆，并对其进行免疫学及核苷酸序列测定。结果筛选得到的ＳｃＦｖ片段具有抗ＨＣＶ核心蛋白的特异性，基因序列分析结果表明符合人源单链可变区抗体基因序列的结构特征。结论利用噬菌体抗体库技术，成功获得ＨＣＶ核心蛋白的特异性人源单链可变区抗体的编码基因。
- 钟彦伟成军施双双夏小兵王刚杨继珍陈菊梅
- 关键词：噬菌体丙型肝炎病毒病毒核心蛋白
- HBsAg人源噬菌体单链抗体的筛选及其在临床诊断中的应用被引量：18
- 2002年
- 目的 筛选乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (HBsAg)的人源噬菌体单链抗体 ,并探讨其在临床治疗和诊断中的应用价值。方法 以HBsAg阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体 (ScFv) ;用该抗体对 10例石蜡包埋的乙型肝炎患者肝组织进行免疫组化鉴定。结果 酶联免疫吸附法 (ELISA)结果表明 ,制备的HBV人源单链抗体能与HBsAg抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别乙型肝炎患者肝组织中的HBsAg抗原 ,与正常肝组织及丙型肝炎病毒 (HCV)的抗原均无交叉反应。结论 此法制备的单链抗体亲和性好 ,特异性强 ,且制备方法简便 ,周期短 ,为HBV病原的检测提供了新的有效试剂 ,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。
- 钟彦伟成军施双双赵景民王刚夏小兵田小军李莉张玲霞
- 关键词：HBSAG免疫组织化学乙型肝炎病毒表面抗原
- 抗HBsAg人源单链可变区抗体的筛选与可溶性抗体的表达被引量：12
- 2001年
- 采用噬菌体表面展示技术 ,以从乙型肝炎病毒 (HBV)表面抗原 (HBsAg)阳性血清超速离心纯化的HBsAg为固相抗原 ,从噬菌体单链可变区半合成抗体库中经过 5轮“吸附 洗脱 扩增”筛选过程 ,获得特异性较强的HBsAg人源单链可变区抗体 (ScFv)克隆并提取质粒 ,经SfiⅠ /NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到 pCANTAB5E表达载体中 ,转化大肠杆菌XL1 Blue。经IPTG诱导后 ,表达的可溶性HBsAg特异性ScFv以 5 0 %硫酸胺沉淀 ,经SDS PAGE电泳表明 ,XL1 Blue中表达的HBsAg可溶性ScFv的分子量约 2 8kD。免疫活性检测结果表明 ,该单链抗体具有较强的抗原结合活性和特异性。HBsAg人源单链抗体的筛选和表达成功 ,为今后HBsAg人源抗体的研究和应用奠定了基础。
- 钟彦伟成军施双双夏小兵李克董菁刘妍杨继珍
- 关键词：HBSAG噬菌体单链抗体HBV
- 抗丙型肝炎病毒非结构蛋白NS_3单链抗体的制备及免疫组织化学研究
- 2001年
- 钟彦伟王松山赵景民成军张玲霞
- 关键词：单链抗体NS3免疫组织化学
- 应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A结合蛋白被引量：5
- 2004年
- 目的 筛选丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS4A结合蛋白 ,为HCV致病机制的研究探索新的途径。方法 应用噬菌体展示技术 ,以HCV非结构蛋白NS4A作为固相筛选分子 ,对T7噬菌体人肝细胞cDNA文库进行 5轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,经噬斑的PCR扩增后 ,构建克隆载体 ,最后对所筛选克隆进行DNA序列测定和同源性分析。结果 噬菌体经富集后 ,从随机挑选的 12个克隆中得到 2个阳性克隆 ,成功构建了克隆载体。序列测定后经过序列同源性分析 ,确定了与HCV非结构蛋白NS4A结合的是肝细胞蛋白 丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)激活蛋白激酶 5 (MAPKAPK5 )。结论 用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HCV非结构蛋白NS4A的结合蛋白 ,为进一步研究HCV的致病机制奠定了良好的基础。
- 钟彦伟成军张忠东杨艳杰李强董菁黄燕萍刘敏王建军
- 关键词：噬菌体展示技术C型肝炎样病毒属病毒非结构蛋白质类基因文库
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3抗原模拟表位的筛选和鉴定st被引量：4
- 2003年
- 目的 筛选丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3(HCVNS3)特异性噬菌体模拟表位 ,为抗 HCV的疫苗研究探索新途径。方法 以抗 HCVNS3的单克隆抗体作为固相筛选分子 ,对人工合成的噬菌体随机七肽库进行 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程 ,随机挑取 6 0个克隆 ,经噬菌体酶联免疫吸附法 (ELISA)鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验 ,最后对所选克隆进行DNA序列分析 ,以确定HCVNS3抗原的模拟表位。结果 经噬菌体富集后 ,从随机筛选的 6 0个克隆中得到 13个阳性克隆 ,确定氨基酸序列SRNTxKL为HCVNS3的模拟表位。结论 用噬菌体七肽库成功筛选得到HCVNS3的模拟表位。
- 钟彦伟成军王刚田小军陈新华李克李莉张玲霞陈菊梅
- 关键词：丙型肝炎病毒模拟表位疫苗研究丙型肝炎
- 抗丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体的制备及免疫组织化学研究被引量：1
- 2004年
- 目的 制备丙型肝炎病毒核心蛋白单链抗体并进行免疫组织化学研究。方法 以大肠杆菌表达的重组丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白为固相抗原 ,利用抗原 抗体亲和性结合的原理 ,从半合成的人源可变区噬菌体抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验 (ELISA)和DNA序列分析 ,获得HCV核心蛋白的人源单链抗体 ;用该抗体对 772 1转染全长HCVcDNA后筛选的阳性克隆细胞中的HCV核心蛋白抗原进行免疫组化鉴定。结果 ELISA结果表明 ,制备的HCV核心蛋白人源单链抗体能与HCV核心蛋白抗原特异性结合 ;免疫组化结果表明 ,该抗体能够特异性识别HCV核心蛋白抗原 ,与正常肝细胞无交叉反应。结论 此法制备单链抗体方法简便 ,周期短 ,可为HCV核心蛋白病原的检测提供新的检测手段。
- 钟彦伟成军焦成松张忠东李强李莉陈菊梅
- 关键词：C型肝炎样病毒属病毒核心蛋白质类单链抗体免疫组织化学
- 丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体在大肠杆菌中的表达被引量：1
- 2004年
- 目的 在大肠杆菌中表达丙型肝炎病毒核心蛋白人源抗独特型单链抗体。方法 采用噬菌体表面展示技术 ,将丙型肝炎病毒 (HCV)核心蛋白单克隆抗体固相包被于Nunc板。从人源噬菌体单链可变区抗体库中经过 3轮“吸附 洗脱 扩增”的筛选 ,获得结合活性较强的人源HCV核心蛋白抗独特型 (抗 Id)scFv阳性克隆。从阳性克隆中提取质粒 ,经SfiⅠ/NotⅠ酶切鉴定后 ,亚克隆到pCANTAB5E载体 ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,应用异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (IPTG)诱导表达可溶性的HCV核心蛋白抗独特型单链可变区抗体。酶联免疫吸附法 (ELISA)证实表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv具有与HCV核心蛋白单克隆抗体反应的特异性。对转化的大肠杆菌XL1 Blue上清中表达的HCV核心蛋白抗 IdscFv进行硫酸铵沉淀 ,并进行SDS PAGE电泳。结果 筛选得到的HCV核心蛋白抗 IdscFv片段基因由 774bp组成。SDS PAGE电泳表明 ,大肠杆菌XL1 Blue中表达的可溶性HCV核心蛋白抗 IdscFv分子量约 2 8kD。结论 HCV核心蛋白抗 IdscFv与HCV核心蛋白抗 IdscFv单克隆抗体具有较强的结合活性和特异性。HCV核心蛋白抗 IdscFv的筛选和表达成功 ,为今后HCV核心蛋白抗 IdscFv的研究和应用奠定了基础。
- 钟彦伟成军张忠东李强李莉陈菊梅
- 关键词：C型肝炎样病毒属病毒核心蛋白质类基因表达
