国家自然科学基金(39770336)
- 作品数：17 被引量：28H指数：4
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- bcr-abl基因免疫诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞杀伤功能
- 2001年
- 目的 研究 bcr- abl融合基因免疫在慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukem ia CML )中的作用以及探讨CML 基因免疫治疗的可行性 .方法 设计两条引物扩增 bcr-abl融合位点两侧约 490 bp大小的 c DNA,经测序鉴定正确后 ,将其克隆至真核表达载体 pc DNA3.1,通过电穿孔法转染至 p815细胞 ,应用 G418筛选建立稳定的靶细胞 ,同时将重组真核表达载体肌肉免疫 BAL B/ c小鼠以获取特异的效应细胞 ,乳酸脱氢酶 (L DH)法检测特异性杀伤率 .结果 1PCR扩增出可用于基因免疫的位于 bcr- abl融合基因位点两侧的490 bp大小的 c DNA,序列测定除第 45 2位碱基 C突变为 T外其余序列均正确 ;2构建了重组真核高效表达载体 ,命名为pc DNA/ bcr- abl;3G418梯度筛选建立了稳定表达该融合基因的细胞系 ,逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)检测到该细胞系有 bcr- abl m RNA水平的表达 ;4bcr- abl基因免疫后的小鼠能有效诱导出特异性细胞毒 T细胞 (cytotoxic T lymph-cyte,CTL) .结论 位于融合位点两侧的 bcr- abl基因肌肉免疫小鼠能够诱导特异性 CTL ,杀伤 bcr-
- 刘楠孙秉中冯琦高杰英罗振革彭虹刘永全
- 关键词：ABL细胞毒性BCR-ABL
- RNA特异性干扰bcr-abl融合基因联合p27基因克隆对K562细胞的影响
- 2010年
- 本研究旨在探讨RNA干扰抑制慢性髓系白血病bcr-abl融合基因表达,以及RNAi和p27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。以细胞系K562为研究对象,合成并转染针对K562细胞bcr-abl融合基因融合位点的21nt siRNA,应用Northern blot法检测bcr-abl融合基因的表达,Western blot法检测BCR-ABL蛋白及凋亡相关蛋白BCL-xL的表达;同时应用RT-PCR扩增p27基因,构建P27-pcDNA3.1载体,转染p27基因入缺失p27基因的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株;经Western blot证实有P27蛋白表达后,联合应用RNA干扰及p27基因克隆,通过MTT法及流式细胞仪等检测联合作用后对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。结果表明,RNA干扰组K562细胞bcr-abl融合基因的表达水平明显下降,转染24小时时有18.4%的K562细胞发生凋亡,细胞凋亡相关蛋白BCL-xL的表达水平下调,出现明显的G1期阻滞;表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株。流式细胞仪检测显示,G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少;RNA干扰与p27基因克隆联合作用于K562细胞后,凋亡细胞比例明显上升(33.4%)。MTT法显示,细胞存活率较单纯p27-K562细胞组及RNA干扰-K562细胞组均明显下降(p<0.01和p<0.05)。结论:特异性siRNA分子可以抑制bcr-abl融合基因的表达,诱导K562细胞分化或凋亡。RNA干扰联合p27基因克隆对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。
- 王玮杜艳林国强李楠楠孙秉中
- 关键词：RNA干扰K562细胞
- MAPK反义寡核苷酸对K562细胞系的增殖抑制作用被引量：3
- 2003年
- 目的 :探讨MAPK在慢性髓细胞白血病 (CML)信号转导中的作用及其作用机制 .方法 :用脂质体转染法将MAPKASO导入K5 6 2细胞中 ,通过集落形成、DNA合成、蛋白质含量和MAPK活性的变化检测MAPKASO对K5 6 2细胞的作用 .结果 :MAPKASO可明显抑制细胞集落形成、DNA合成、蛋白质含量和MAPK活性 ,其抑制率分别为 4 6 .1% ,5 7.1% ,4 3.2 %和 6 2 .0 % ,与对照组比较有显著差异 (P <0 .0 5 ) .结论 :MAPK在CML信号转导中起重要作用 。
- 尚振川孙秉中陈志南王玮冯琦王莎张涛
- 关键词：白血病反义
- PD98059对慢性髓细胞白血病Ras-MAPK信号转导的作用被引量：6
- 2003年
- 目的:探讨PD98059对慢性髓细胞白血病信号转导的作用及其作用机制。方法:将PD98059加入慢性髓细胞白血病细胞系K562细胞中,通过细胞活力、DNA合成、集落形成和MAPK活性的变化,观察PD98059对慢性髓细胞白血病信号转导的作用。结果:PD98059可明显抑制K562细胞活力、DNA合成、集落形成和MAPK活性(与对照组比较,P<0.05),其抑制作用具有浓度依赖性。结论:PD98059可通过阻断Ras-MAPK信号通路而发挥其抑制作用。Ras-MAPK通路极有可能成为CML治疗的新靶点。
- 尚振川孙秉中冯琦王玮王莎张涛陈志南王晶
- 关键词：PD98059慢性髓细胞白血病RAS-MAPK信号转导
- 酪氨酸激酶抑制剂STI571治疗慢性粒细胞白血病的研究被引量：1
- 2005年
- 目的:研究特异性酪氨酸激酶抑制剂STI571对慢性粒细胞白血病(简称慢粒)细胞增殖、凋亡、周期调控及bcr-abl融合基因表达的影响,为慢粒的基因治疗提供理论依据。方法:细胞培养慢粒急变细胞系K562细胞株,通过MTT检测STI571作用下细胞存活率,流式细胞仪检测周期变化,电镜及DNA电泳检测细胞凋亡,半定量RT-PCR检测STI571对bcr-abl融合基因表达的影响。结果:STI571作用后K562细胞中G1期细胞明显增加,S期细胞明显减少。流式细胞图中的二倍体峰前可见一明显亚二倍体峰———凋亡峰(apoptosispeak),提示STI571能明显诱导K562细胞凋亡。电镜发现STI571作用于K562细胞12～72h后,诱导出各期凋亡细胞及凋亡小体。半定量PCR灰度扫描结果显示bcr-abl基因的mRNA表达下降,电泳检测扩增产物,荧光亮度减弱。结论:STI571能明显抑制白血病细胞增殖,细胞阻滞于G0/G1期,且具有明显的诱导凋亡作用,反馈抑制bcr-abl融合基因的表达。
- 王玮孙秉中药立波刘新平
- 关键词：蛋白质酪氨酸激酶凋亡STI571BCR-ABL融合基因慢性粒细胞白血病酪氨酸激酶抑制剂K562细胞凋亡
- 格列卫与六亚甲基二乙酰胺对K562细胞增殖和凋亡的影响
- 2004年
- 目的 :研究格列卫和六亚甲基二乙酰胺 (HMBA)对K5 6 2细胞增殖、凋亡、细胞周期及周期蛋白表达的影响 .方法 :MTT法观察细胞生长指数和细胞存活率 ,流式细胞仪、电镜检测细胞周期和凋亡 ,半定量RT PCR检测bcr abl基因的表达 ,Westernblotting检测蛋白表达 .结果 :联合应用两种药物后细胞存活率明显下降 ,凋亡比例略下降 ,细胞周期阻滞于G0 /G1 期 ,cyclinD1、cyclinE、cyclinA、CDK4、c myc蛋白表达下调 .结论 :两种药物应用后出现细胞存活率下降、细胞周期阻滞、周期蛋白表达下调、凋亡比例下降 ,联合作用对细胞的增殖抑制具有协同作用 。
- 王玮孙秉中刘新平冯琦尚振川曹云新药立波
- 关键词：格列卫六亚甲基二乙酰胺增殖抑制细胞周期脱噬作用
- CRKL基因反义寡核苷酸诱导K562细胞的凋亡被引量：2
- 2002年
- 背景与目的:近几年研究发现,CRKL(CT10regulatorofkinaselike)基因编码的蛋白在慢性粒细胞白血病(chronicmyeloidleukemia,CML)发病中起重要作用。本实验研究CRKL基因反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病细胞系K562细胞凋亡的影响。方法:以脂质体为载体,用CRKL基因反义寡核苷酸转染K562细胞,通过活细胞计数、透射电镜、流式细胞术、DNALadder测定观察K562细胞形态学、细胞周期、基因表达等的变化。结果:在CRKL基因反义寡核苷酸作用下,K562细胞的生长明显出现抑制;流式细胞仪检测见二倍体峰前出现凋亡峰;在电镜下可见处于凋亡各期的K562细胞;提取其基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳,可见明显的细胞凋亡梯状条带。而对照组K562细胞未观察到上述变化。结论:CRKL基因是Ph染色体阳性CML发病的重要因素。
- 王莎孙秉中于文强张涛冯琦尚振川
- 关键词：反义寡核苷酸凋亡慢性粒细胞白血病
- 酪氨酸激酶抑制剂STI571与P21^(WAF)基因克隆治疗慢性粒细胞白血病的实验研究
- 2004年
- 本研究探讨酪氨酸激酶抑制剂STI5 71和P2 1WAF基因克隆对慢性粒细胞白血病急变K5 62细胞株的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的治疗作用。RT PCR扩增P2 1WAF基因 ,胶纯化回收后连接到T载体测序 ,序列正确后构建P2 1 pcDNA3 .1载体 ,将P2 1 pcDNA3 .1与空载体分别以脂质体转染入P2 1蛋白表达缺如的K5 62细胞 ,经筛选得到G4 18抗性的K5 62细胞株 ,Westernblot证实转染后有P2 1蛋白表达 ,MTT法检测细胞存活率 ,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果表明 :表达外源性P2 1蛋白的P2 1 pcDNA3 .1 K5 62细胞株生长速度明显慢于对照K5 62细胞株 ,流式细胞仪显示G0 /G1期细胞增多 ,MTT法显示P2 1 pcDNA3 .1 K5 62细胞与STI5 71联合应用后 ,与单用STI5 71作用的K5 62细胞相比 ,凋亡细胞比例轻度减少 ,细胞存活率下降较慢。结论 :表达外源P2 1蛋白能抑制K5 62细胞增殖 ,同时对STI5 71的促凋亡作用有轻度抑制 ,并降低K5 62细胞对STI5 71的敏感性。
- 王玮孙秉中刘新平冯琦尚振川曹云新药立波
- 关键词：ST1571慢性粒细胞白血病
- p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞作用的研究被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖、周期及凋亡等的调控作用。方法:RT-PCR扩增p16基因,胶纯化回收后连接到T载体测序,序列正确后构建p16-pcDNA3.1载体,将p16-pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入p16基因缺失的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株,Westernblot证实转染后有p16蛋白表达,MTT法检测细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:反复测序发现,从K562细胞中扩增的DNA片段属于非特异性扩增,证实K562细胞中p16基因缺失。转染p16基因后表达外源性p16蛋白的p16-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显减慢;伊马替尼作用于已转染p16-pcDNA3.1的K562细胞,其细胞存活率与伊马替尼作用未转染K562细胞及单纯转染p16-pcDNA3.1的K562细胞相比均明显降低。转染p16基因后G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少,p16-pcDNA3.1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升。结论:p16基因抑制K562细胞增殖并调节其周期,外源p16联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。
- 王玮孙秉中刘庆春药立波
- 关键词：白血病P16基因克隆
- Genistein对K562细胞生长及CyclinD1基因和bcr-abl融合基因表达的影响被引量：4
- 2001年
- 目的 研究 Genistein抑制 K5 62细胞生长的机制及对 Cyclin D1基因和 bcr- abl融合基因表达的影响 .方法 用RT- PCR方法检测 Genistein作用于 K5 62细胞前后 Cyclin D1基因和 bcr- abl融合基因的 m RNA表达变化 ,用免疫荧光、流式细胞仪和电镜检测 CDK4蛋白的表达、细胞周期及凋亡 .结果 K5 62细胞中 Cyclin D1基因、bcr- abl融合基因的 m R-NA和 CDK4蛋白表达阳性 ,用 Genistein与 K5 62细胞共同孵育后 ,bcr- abl融合基因的 m RNA表达阴性 ,Cyclin D1的m RNA和 CDK4蛋白表达下降 ,细胞阻滞于 G2 / M期 ,K5 62细胞出现凋亡 .结论 bcr- abl融合基因、 Cyclin D1基因和CDK4蛋白在 K5 62细胞中高表达 ,Genistein能使 K5 62细胞生长受抑 ,诱导其凋亡 ,抑制 bcr- abl基因的 m RNA表达 ,并使 Cyclin D1基因的 m RNA和 CDK4蛋白表达下降 ,表明bcr- abl融合基因、Cyclin D1基因和 CDK4对慢粒发展存在内在关系 .
- 王玮孙秉中于文彬冯琦
- 关键词：CYCLIND1基因CDK4蛋白BCR-ABL融合基因
