上海市教育发展基金会“曙光计划”项目(03SG37)
- 作品数：2 被引量：3H指数：1
- 相关作者：林兰意周霞秋王晖姜山刘芸野更多>>
- 相关机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院中国科学院上海生命科学研究院更多>>
- 发文基金：上海市教育发展基金会“曙光计划”项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 小鼠半胱天冬酶-12特异性小干扰RNA真核表达载体的构建及鉴定被引量：2
- 2007年
- 目的构建小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12(Caspase-12)基因特异性小干扰RNA (siRNA)表达载体并检测其表达。方法参照siRNA模板设计原则,设计并合成3对针对caspase- 12不同位点的siRNA,分别在脂质体介导下转染小鼠肝癌细胞株Hepal-6,24 h收集细胞;RT-PCR分析不同位点siRNA对靶基因mRNA表达的抑制,筛选出抑制效率最高的位点;将此位点siRNA模板序列插入质粒pRNAT-H1.1Neo中,PCR分析及基因测序进行鉴定;构建成功的重组质粒转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,实时荧光定量PCR分析caspase-12 mRNA表达;Western印迹检测Caspase-12的表达。数据行t检验。结果RT-PCR分析表明,第一对siRNA(siRNA*1)对caspase- 12基因表达的抑制效率最高;重组质粒pRNAT-H1.1Neo-caspase12(pRNAT-casp12)经PCR分析及测序表明,siRNA*1模板序列成功插入预计位点,且序列正确;pRNAT-easp12转染Hepal-6细胞48 h和72 h后,与空质粒对照组相比,caspase-12 mRNA水平分别下降72.5%和59.5%(P<0.05);pRNAT-casp12转染后,caspase-12酶原表达量在24、48和72 h分别下调17.1%、37.3%和60.1%,48 h和72 h的抑制率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建小鼠caspase-12特异性siRNA真核表达载体,它对小鼠肝癌细胞caspase-12基因的表达具有显著和特异的抑制作用。
- 林兰意谢青王晖姜山周霞秋刘芸野俞红郭清金由辛
- 关键词：内质网应激半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶RNA干扰
- 半胱天冬氨酸蛋白酶-12小干扰RNA对小鼠肝细胞凋亡的阻抑被引量：1
- 2007年
- 目的观察小鼠半胱天冬氨酸蛋白酶-12(caspase-12)基因特异性小干扰RNA (siRNA)构建的表达载体pRNAT-casp12对caspase-12基因的抑制及其对内质网应激介导的小鼠肝细胞凋亡的影响。方法以小鼠肝细胞株Hepa 1-6为靶细胞,利用脂质体与重组质粒pRNAT- caspl 2共转染,分别在转染24、48和72 h后收集细胞,采用实时荧光定量PCR分析和Western印迹检测caspase-12的表达;利用毒胡萝卜素(TG)诱导细胞,建立内质网应激介导的细胞凋亡模型,通过DNA梯带凝胶电泳检测,选出适合的诱导时间;TG诱导已转染了pRNAT-casp12的干扰组细胞后,以空质粒转染组为对照,利用Western印迹检测caspase-12蛋白表达水平的变化,通过DNA梯带凝胶电泳、流式细胞仪、Hoechst 33258染色等方法检测细胞凋亡,观察caspase-12 siRNA对细胞凋亡的影响。结果pRNAT-casp12转染细胞24、48和72 h后,caspase-12 mRNA的水平分别下降了45.6%、72.5%和59.5%;caspase-12蛋白表达下降了17.1%、37.3%和60.1%;2μmol/L TG处理细胞30 h后,成功诱导细胞凋亡;与对照组相比,干扰组细胞经TG诱导后,caspase-12蛋白表达水平下降了54.6%,流式细胞仪检测发现早期调亡率下调了51.4%(P<0.01)。结论小鼠caspase-12 siRNA对Hepa 1-6细胞caspase-12基因的表达具有显著的抑制作用,能够明显阻抑内质网应激介导的凋亡,有望发展成为新一代抗凋亡药物。
- 林兰意谢青王晖姜山周霞秋刘芸野俞红郭清金由辛
- 关键词：细胞凋亡半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
