国家高技术研究发展计划(2006AA02Z451) 作品数:10 被引量:48 H指数:4 相关作者: 吴秀萍 刘明远 王学林 于申业 邓洪宽 更多>> 相关机构: 吉林大学 新疆生产建设兵团 更多>> 发文基金: 国家高技术研究发展计划 国家自然科学基金 国际科学基金 更多>> 相关领域: 医药卫生 农业科学 生物学 更多>>
伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库的构建及筛选 被引量:1 2008年 目的获取伪旋毛虫(Trichinella pseudospiralis)肌幼虫时期抗原性基因。方法利用λZAP载体构建伪旋毛虫肌幼虫cDNA表达文库;以感染伪旋毛虫60天后的猪血清为抗体探针,对伪旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫学筛选,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析。结果构建的伪旋毛虫cDNA表达文库的库容量为0.55×106pfu,重组率为95.6%,扩增后文库滴度为1.2×1010pfu/mL。从2.0×105个重组噬菌体筛选获得阳性克隆27个。序列分析结果表明这27个阳性克隆共编码7种cDNA分子,其编码的类似蛋白分别为伪旋毛虫Tp21kDa蛋白、伪旋毛虫Tp28kDa蛋白、蛋白酶体激活因子亚单位(Proteasome activator subunit)类蛋白、Nudix水解酶(Nudix hydrolyase)类蛋白、凝集因子(Condensin)类蛋白、尿嘧啶糖基化酶(uracil glycosylase)类蛋白和一个未知蛋白。结论获得两个反应原性较强且高拷贝的抗原基因,其分别编码Tp21kDa蛋白及蛋白酶体激活因子亚单位。 吴秀萍 赫荣华 高丽芳 付宝权 王学林 R. Blaga 邓洪宽 于申业 P. Boireau 王峰 刘明远关键词:肌幼虫 CDNA表达文库 旋毛虫虫体蛋白对肝癌细胞H7402的抑制作用 被引量:14 2007年 目的:研究旋毛虫虫体蛋白对肝癌H7402细胞的抑制作用,确认其对肝癌细胞的抗肿瘤活性。方法:通过体内、体外培养获得旋毛虫成虫与新生幼虫的混合物,采用匀浆、离心方法制备旋毛虫虫体蛋白,紫外分光光度计检测蛋白浓度。分别设0.035、0.070、0.140 mg/ml与H7402细胞作用为实验组,并设虫体蛋白对正常肝细胞HL-7702细胞作用为对照组,采用MTT检测细胞增殖能力,划痕实验、侵袭实验检测旋毛虫虫体蛋白对H7402的迁移及侵袭能力的影响,采用TUNEL法和流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡和细胞周期。结果:成功制备了旋毛虫虫体蛋白。0.035、0.070、0.140 mg/ml旋毛虫虫体蛋白对H7402细胞增殖的抑制率分别为(22.40±13.80)%、(29.45±16.80)%、(39.38±17.80)%。TUNEL实验和流式细胞术可观察到旋毛虫虫体蛋白诱导H7402凋亡,其凋亡率为(39.07±0.90)%,细胞周期阻滞于S期。划痕和侵袭的实验表明旋毛虫虫体蛋白对H7402细胞迁徙能力有抑制作用,对其侵袭的抑制率为(63.79±13.71)%。结论:旋毛虫虫体蛋白对肝癌H7402细胞的增殖、迁移和侵袭具有抑制作用,可能是一个有潜在应用价值的抗肝癌生物制剂。 王学林 杨世杰 吴秀萍 于申业 叶春艳 邓洪宽 魏征仁 王卫芳 王芯蕊 刘明远关键词:旋毛虫 抗肿瘤 抗增殖 噬菌体展示技术及其应用 被引量:15 2008年 噬菌体展示技术是一项新兴的分子生物学技术;该技术将基因型和表现型有效地联系起来,是后基因组时代的有力工具。目前用于构建展示文库的噬菌体主要有丝状噬菌体、λ噬菌体、T4噬菌体和T7噬菌体;它们所展示的外源蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性。随着此项技术的不断完善和发展,噬菌体展示技术已在新型疫苗的研制、酶抑制剂的筛选、医学诊断和治疗、多肽药物的开发、蛋白质相互作用的研究等领域得到了广泛的应用,并显示了良好的应用前景。 刘相叶 邓洪宽 吴秀萍 王学林 于申业 于艳玲 刘明远关键词:噬菌体展示技术 旋毛虫T668基因转录及表达的时空特性鉴定 被引量:3 2008年 采用RT-PCR和免疫荧光染色技术,分别检测T668基因mRNA及蛋白在旋毛虫不同发育时期中的时空表达情况。RT-PCR结果显示,该基因从旋毛虫新生幼虫出生即开始转录,随着日龄的增加,T668基因mRNA逐渐减少,在感染后11~14 d T668基因的转录趋于停止。免疫荧光染色结果表明,在感染后1d,旋毛虫虫体即有T668蛋白表达;感染后6~13d,T668蛋白分泌到肿大的肌细胞核上;14~20d,肿大的肌细胞核上基本观察不到T668蛋白,但整个虫体仍有很强的蛋白表达。这提示在旋毛虫的寄生过程中,T668基因的转录及表达呈一定的时空特点,这可能对旋毛虫包囊形成有着重要作用。 王学林 王心蕊 吴秀萍 孙磊 于申业 李文辉 刘明远关键词:旋毛虫 RT-PCR 免疫荧光 旋毛虫肌幼虫强反应原性抗原基因的筛选及生物学特性分析 被引量:6 2008年 应用感染旋毛虫60 d猪血清为抗体探针,对旋毛虫肌幼虫cDNA文库进行免疫筛选,获得旋毛虫肌幼虫期强反应原性抗原基因,利用生物学信息网站(NCBI、BLAST等)及其相关软件(DNA star等)对获得的基因进行序列分析。结果表明:筛选约2.5×105个重组噬菌体,获得13个阳性克隆,有6个克隆为同一个基因,编码蛋白与染色体结构维持蛋白(SMC蛋白,structural maintenance of chromosome proteins)同源性为48.1%,在免疫筛选中均有较强的反应信号;有3个克隆为同一个已知基因(AAF63473),编码蛋白与丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serine protease inhibitor)同源性为99%,在免疫筛选中反应信号次之;还有2个为同一个基因,与旋毛虫线粒体(Mitochondrion ofTrichinella spiralis)DNA有较高的同源性(同源性为87.7%),编码核糖体大亚基RNA,其他2个为未曾报道过的新基因,编码不同的未知蛋白,这4个克隆在免疫筛选过程中反应信号相对较弱。得到的2个强反应原性的旋毛虫肌幼虫cDNA分子,其中相对信号最强cDNA分子编码SMC蛋白,另一个编码丝氨酸蛋白酶抑制因子,二者有望用于旋毛虫病的诊断候选抗原基因。 吴秀萍 赫荣华 邹洪斌 杨志东 P.Boireau 刘明远关键词:旋毛虫 肌幼虫 反应原性 抗原基因 旋毛虫Serpin基因的体外表达及其特性鉴定 被引量:7 2009年 目的体外表达旋毛虫丝氨酸蛋白酶抑制因子(Serpin)基因,并检测其在旋毛虫不同发育时期mRNA转录、蛋白表达与分子定位及反应原性情况,为以其作为候选诊断抗原基因提供实验依据。方法根据旋毛虫Serpin基因序列,以重组质粒pBlue-script-WM5为模板,利用PCR技术去除其全长cDNA的信号肽序列,采用原核表达载体pET-28a构建不含该基因信号肽的、融合蛋白不含组氨酸标签的重组表达质粒pET-28a-WM5,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物纯化后,采用Westernblot法检测反应原性。免疫组织化学技术检测Serpin蛋白在旋毛虫不同发育时期的表达及定位情况。采用RT-PCR和实时定量RT-PCR技术检测Serpin基因在旋毛虫不同发育时期的转录水平。结果重组质粒pET-28a-WM5经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,Serpin基因能够在大肠杆菌中高效表达。重组蛋白主要以包涵体形式存在,约占菌体总蛋白的51.1%。纯化后的重组蛋白纯度可达98%,与猪抗旋毛虫60d抗血清有较好的反应原性,与26d猪抗血清无明显反应信号;RT-PCR与实时定量RT-PCR结果显示,该基因在旋毛虫不同发育时期均有转录,但转录水平有明显差异,有2个转录高峰期(Ad2/Ad3和ML)以及1个转录水平明显下降期(Ad5);免疫组化鉴定表明,Serpin天然抗原在旋毛虫肌幼虫时期18d开始表达,且在感染35d后大量表达和分泌。结论已获得较高纯度的旋毛虫Serpin体外表达融合蛋白,其具有较好的反应原性。旋毛虫Serpin基因具有期特异性表达的特点,且在肌幼虫期具有高转录与高表达水平,可作为捕获旋毛虫肌幼虫期循环抗体的候选诊断抗原基因。 吴秀萍 于申业 刘相叶 王学林 杨勇 王子见 夏慧卿 邓洪宽 Boireau P 刘明远关键词:旋毛虫 旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因的筛选与分析 被引量:3 2009年 筛选旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因。利用λZAP载体构建旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库。用感染旋毛虫26 d猪血清对其进行免疫学筛选,对筛选出的阳性克隆进行测序与分析;应用RT-PCR方法对编码p46 000蛋白强阳性克隆基因在不同发育时期虫体转录情况进行检测。成功构建了旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库,其库容量为1.5×106pfu,重组率为95%,插入片段在400 bp^2 000 bp之间,扩增后文库滴度为1.5×1012pfu/mL。筛选出阳性克隆33个,序列分析表明,有20个克隆为同一已知基因,称为旋毛虫p46 000蛋白,编码旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂,且在筛选过程中反应信号均较强;还发现了一些旋毛虫新基因,如编码Ubc蛋白,GM13181蛋白,Rieske硫铁蛋白1等。本研究获得了一个高丰度、反应原性较强抗原基因,其编码蛋白为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 吴秀萍 刘相叶 王学林 张小玲 王子见 唐斌 陈根元 杨勇 刘明远关键词:旋毛虫 抗原基因 旋毛虫肌幼虫p45cDNA的克隆及鉴定 2008年 目的本研究根据GenBank中旋毛虫45kDa抗原基因的序列设计引物,采用PCR技术从旋毛虫肌幼虫cDNA文库中扩增靶基因p45cDNA,并克隆到pMD-18T载体,转化至大肠埃希氏菌NovaBlue后测序分析。获得827bp的p45cD-NA。该序列与GenBank中的旋毛虫p45基因序列相比共有1个核苷酸发生改变,二者的同源性为99%,其编码蛋白质由268个氨基酸组成,与45kDa抗原的同源性为99%。将p45cDNA克隆到原核表达载体pET28a并转化至表达菌BL21star(DE3)后,经IPTG诱导表达出约30kDa的重组蛋白。Western-blot检测表明,p45重组蛋白可以被旋毛虫感染猪血清识别,具有良好的抗原性。 孙树民 吴秀萍 付宝权 王学林 郭恒 于申业 邓洪宽 刘马峰 P.Boireau 刘明远关键词:旋毛虫 P45 CDNA 克隆 抗原性 旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因的筛选与分析 被引量:1 2009年 目的筛选旋毛虫新生幼虫表达的可与宿主肌细胞染色体DNA结合的相关蛋白基因,寻找旋毛虫侵入及寄生过程中与宿主肌细胞发生结合的相关蛋白,为研究寄生虫与宿主间的信号转导、侵袭及长期寄生机制奠定基础。方法利用噬菌体展示技术构建旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库,用小鼠肌肉染色体DNA对展示文库进行筛选,随机挑选30个阳性克隆,进行PCR鉴定、测序分析和编码蛋白二级结构及翻译后修饰预测。结果旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库的原始文库库容量为2×105pfu,重组率为98%,95%的插入片段长度在250~2000bp之间,扩增后文库滴度为3×1012pfu/ml。对经4轮筛选后的克隆进行PCR鉴定及测序,获得13个基因序列,其中有4个(DN14、DN24、DN9及DN23)为旋毛虫新生幼虫DNA结合相关蛋白基因,分别与旋毛虫未知蛋白及假定ORF11.30、旋毛虫nudix水解酶及血吸虫SJCHGC05997蛋白、秀丽新杆线虫未知蛋白和旋毛虫TGF-β配基具有同源性。经编码蛋白质二级结构及翻译后修饰预测,这4种蛋白可能与旋毛虫包囊形成和寄生虫与宿主间信号转导有关。结论已成功构建了旋毛虫新生幼虫T7噬菌体展示cDNA文库,并利用小鼠肌肉染色体DNA筛选出4个可用于研究旋毛虫包囊形成及与宿主间信号转导机制的候选基因。 吴秀萍 邓洪宽 刘相叶 于录 王学林 Boireau Pascal 刘明远关键词:旋毛虫 旋毛虫新生幼虫脱氧核糖核酸酶Ⅱ基因家族的筛选和分析 被引量:3 2009年 利用旋毛虫新生幼虫期特异性基因N5cDNA作为探针,对旋毛虫新生幼虫cDNA文库进行筛选,并将阳性克隆全部送测序公司测序。对测序结果进行序列分析后,根据信号肽不同分为15种基因。NCBI BLAST检索表明,其中有13种基因均为旋毛虫未知基因序列,并且氨基酸序列最前面均包含有1个信号肽,属于分泌性蛋白。InterProScan检索表明,15种氨基酸序列均编码脱氧核糖核酸酶Ⅱ(DNaseⅡ),均含有DNaseⅡ的保守序列。通过互联网将编码蛋白序列输入CLUSTAL W数据库,检索结果表明,这些编码的脱氧核糖核酸酶Ⅱ蛋白质同源性高达85%-98%。 李莲瑞 吴秀萍 付宝权 卢强 王学林 刘明远关键词:旋毛虫