国家教育部博士点基金(20102325110004)
- 作品数：11 被引量：18H指数：3
- 相关作者：王君伟马波母晓宇高明春张文龙更多>>
- 相关机构：东北农业大学东北林业大学辽宁省动物疫病预防控制中心更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金博士科研启动基金黑龙江省青年科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞上的适应性研究
- 2013年
- 将鸭肝炎病毒(DHV)E53鸡胚致弱株适应鸭胚成纤维细胞(DEF),连续传代至第16代时出现细胞病变(CPE),第21代时CPE呈现规律性,接毒后72hCPE达80%,其病变特征是细胞间隙增宽、细胞崩解死亡、脱落。经病毒细胞培养物滴度测定、RT-PCR检测和间接免疫荧光法鉴定,证明DHVE53株能够在DEF上增殖。
- 李鑫朱永梅母晓宇马波王君伟
- 关键词：鸭肝炎病毒鸭胚成纤维细胞
- 鸭减蛋综合征抗体消长规律初步研究
- 2012年
- 减蛋综合征（Egg drop syndrome,EDS-76）是由减蛋综合征病毒（EDSV）引起的一种以产蛋鸡产薄壳或无壳蛋,产蛋率严重下降为主要特征的传染病。减蛋综合征病毒又称鸭腺病毒,一些研究表明,尽管发生疾病都是在产蛋鸡,但鸭才是EDSV的天然贮存宿主[1],
- 王晓东于志丹李鑫马波王君伟
- 关键词：减蛋综合征病毒抗体消长规律发生疾病EDSV无壳蛋
- 鸭肠炎病毒gB N端(60～110aa)抗原优势区的原核表达及抗血清的制备
- 2015年
- 以本实验室已克隆的鸭肠炎病毒（DEV）C-KCE株ul27基因序列为模板,设计特异性引物,PCR扩增获得编码鸭肠炎病毒gB N端第60～110aa的目的基因片段,大小为150bp。将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-32a（＋）中,阳性质粒被命名为pET-32a（＋）-gB-1。经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为27ku。用Ni-NTA柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,鸭抗DEV阳性血清经间接ELISA检测证实其具有抗原性,并以此为免疫原免疫家兔制备抗血清,经间接ELISA检测,抗血清效价为1∶25 600。应用间接免疫荧光及Western-blot分析制备的抗血清的反应性,均证实抗血清可特异性识别DEV gB蛋白。分别以重组蛋白和DEV超离病毒为检测抗原进行间接ELISA,检测DEV免疫鸭的抗体消长规律,结果显示两者的抗体变化趋势一致。以上结果表明,制备的抗血清可作为DEV检测的候选试剂,表达的重组蛋白可作为DEV抗体检测的诊断抗原。
- 曹春秋张树栋刘琪董井泉高明春张文龙许丽于长泳马波王君伟
- 关键词：鸭肠炎病毒GB原核表达抗血清
- 鹅IgA重链恒定区的原核表达及其多克隆抗体的制备
- 2013年
- 为了研究鹅免疫球蛋白的生物学功能,试验采用PCR技术,参考鹅IgA重链恒定区(F)基因序列设计引物,扩增出F基因,构建了含有F基因的重组原核表达质粒pET-28a-GoIgA-C,目的基因为1 339 bp,再进行IPTG诱导表达、ELISA检测和Western-blot分析。结果表明:获得了F的重组蛋白,分子质量约为50 ku,切胶纯化并以其为免疫原制备了多克隆抗体,抗体效价在1∶25 600以上;制备的多克隆抗体具备与鹅IgA反应的性质,与人、猪、牛和鸡免疫球蛋白均不发生反应。说明试验成功获得了F重组蛋白及小鼠多克隆抗体。
- 盛巧玲郭永丽魏双施王璞高明春王君伟
- 关键词：基因原核表达多克隆抗体
- 鸭肠炎病毒C-KCE株TK基因的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：3
- 2015年
- 为了探究鸭肠炎病毒(DEV)TK基因编码蛋白在相关细胞上作用与功能及其在病毒感染周期、机体免疫应答中的作用,试验以DEV C-KCE株基因组DNA为模板扩增获得TK基因,在p ET-32a(+)/Rosetta(DE3)p Lys系统中原核表达,并用IPTG诱导DEV TK重组蛋白。结果表明:经SDS-PAGE分析,外源基因主要以包涵体形式表达,分子质量约为59 ku;经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,抗体效价可达到1∶4;经Western-blot分析,制备的多克隆抗体可特异性识别重组蛋白;间接免疫荧光试验证实,制备的多克隆抗体与DEV的TK基因编码产物反应性良好。说明TK基因表达蛋白在鸭肠炎感染周期及机体的免疫应答中发挥着至关重要的作用。
- 赵宇田荔母晓宇董井泉高明春张文龙马波王君伟
- 关键词：TK基因原核表达多克隆抗体WESTERN-BLOT间接免疫荧光试验
- 鸭肠炎病毒gB抗原优势区的表达及其多克隆抗体的反应特性被引量：4
- 2015年
- 拟制备鸭肠炎病毒(DEV)gB抗原优势区的多克隆抗体,初步应用于该病毒的检测。以本实验室克隆的DEVC-KCE株ul27基因序列为参考序列设计特异性引物,通过PCR获得DEV gB优势表位区域基因片段gB-AD(331—570bp),并在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLysS系统中进行原核表达。经IPTG诱导获得与预期大小相符的重组蛋白质,以Ni-NTA柱亲和层析法纯化重组蛋白质,利用DEV阳性血清检测重组蛋白质的抗原性,并用切胶纯化的重组蛋白质免疫家兔,制备兔抗DEV gB-AD血清。结果显示,重组蛋白质可被DEV阳性血清特异性识别,制备的兔源多克隆抗体I-ELISA效价为1∶10 240,且其具有中和活性;兔源多克隆抗体在还原电泳条件下显示DEV gB的相对分子质量约为66ku,而在非还原电泳条件下DEV gB显示为相对分子质量约120和66ku的两条目的带,通过间接免疫荧光试验和中和试验进一步证实制备的兔源多克隆抗体可特异性识别鸭肠炎病毒感染细胞所合成的gB蛋白。结果表明,所制备的兔抗DEV gB-AD多克隆抗体可作为检测DEV的试剂,为DEV检测及gB的功能研究提供必要的基础数据和材料。
- 张树栋曹春秋董井泉高明春张文龙郑铁鑫马波王君伟
- 关键词：鸭肠炎病毒GB原核表达多克隆抗体
- 鸭肠炎病毒SORF3基因的原核表达及其多克隆抗体的制备被引量：1
- 2012年
- 以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得SORF3(S3)基因,在pET-32a(+)/Rosetta(DE3)pLys系统中原核表达。S3重组蛋白经IPTG诱导,SDS-PAGE分析显示外源基因以包涵体形式表达为主,分子质量约为52ku。重组蛋白经Ni-NTA纯化后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,琼脂扩散法测得抗体效价为1:4。经Western blotting分析制备的多克隆抗体具有较高的特异性,间接免疫荧光试验证实制备的多克隆抗体与DEV的SORF3编码产物反应性良好,为进一步研究DEVSORF3结构与功能特性奠定了基础。
- 母晓宇董井泉孟祥莉张雪莲马波王君伟
- 关键词：鸭肠炎病毒原核表达
- 鸭肠炎病毒US10基因的原核表达及抗血清的制备
- 2013年
- 以鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株基因组DNA为模板,PCR扩增获得US10基因。构建了其原核表达载体pET-32a-US10,经1.0 mmol/L IPTG诱导,目的蛋白在Rosetta(DE3)pLys宿主菌中获得了表达。SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白以包涵体形式表达,与预期大小相符。利用亲和层析法纯化目的蛋白,以纯化的蛋白为免疫原制备其抗血清,琼脂扩散法测得抗体效价为1∶4,间接ELISA法测定抗体效价为1∶102 400。间接免疫荧光试验证实制备的抗血清可特异性识别鸭肠炎病毒的US10基因编码产物。
- 张蕾董井泉母晓宇马波王君伟
- 关键词：鸭肠炎病毒
- Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及抗体检测ELISA方法的建立被引量：6
- 2014年
- 为鉴定Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)VP1蛋白优势抗原区及建立DHV-Ⅰ抗体检测ELISA方法,本研究以重组质粒pEasy-VP1为模板,将其分为5段(VP1-a^e)及全长VP1经PCR扩增,并分别克隆于pET-32a(+)进行原核表达。经western blot分析表明,截短表达的蛋白VP1-c(80 aa^150 aa)抗原性良好。将其纯化作为包被抗原建立了DHV-Ⅰ抗体的间接ELISA检测方法。经反应条件优化确定:VP1-c包被浓度为2μg/mL,DHV-Ⅰ抗血清稀释度为1∶20,其临界值为0.208。该方法能够特异性检测DHV抗体,与其他常见的几种鸭病阳性血清无交叉反应;其批内和批间重复性试验变异系数均小于9%。应用建立的ELISA方法对48份鸭血清进行了检测,与中和试验相比较,符合率为86.9%。表明该方法可以初步应用于DHV抗体的检测和血清流行病学调查。
- 董井泉张蕾马波师东方王君伟
- 关键词：鸭肝炎病毒VP1蛋白间接ELISA
- 鸭肠炎病毒gD基因胞外区的原核表达及在感染鸭胚成纤维细胞中的定位
- 2012年
- 以本实验室获得的鸭肠炎病毒(DEV)C-KCE株US区基因序列(GenBank登录号EU714267)为基础PCR扩增出gD基因胞外区(gDw),将其定向克隆至原核表达载体pET-30a(+)并转化至大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLys。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表明gD基因胞外区在大肠杆菌中获得与预期大小相符的表达蛋白。重组蛋白纯化后免疫家兔制备多克隆抗体,血清琼扩效价达1∶16,噬斑减数中和试验测定血清中和抗体效价达1∶64。通过免疫荧光技术首次对gD进行亚细胞定位检测,结果表明DEV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)后4h近核区域细胞质内首先开始出现荧光,12h以后显著增加,明显的点状绿色荧光广泛存在于胞质中。本研究为进一步开展DEV gD的功能研究提供了重要数据和材料。
- 刘琰徐凝付培芬母晓宇董井泉马波王君伟
- 关键词：鸭肠炎病毒原核表达
