国家自然科学基金(39770827)
- 作品数：15 被引量：41H指数：4
- 相关作者：隋延仿李增山叶菁张秀敏姜永强更多>>
- 相关机构：第四军医大学军事医学科学院西安交通大学医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 超抗原SEA的基因克隆、原核表达与鉴定被引量：7
- 2002年
- 目的 构建pRSET SEA重组表达载体 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS ,诱导表达超抗原葡萄球菌肠毒素A(staphylococcalenterotoxinA ,SEA) ,进行分离、纯化及westernblot鉴定。方法 采用PCR技术 ,从产SEA的葡萄球菌标准菌株FRI1 0 0基因组DNA中获得SEA全长序列 ,克隆入pUC1 9中 ,进行测序 ,构建pRSET SEA表达质粒 ,转化大肠杆菌BL2 1 (DE3)pLysS ,通过异丙基硫代 β D 半乳糖苷 (isopropyl beta D thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达 ,分离、纯化及westernblot鉴定。结果 PCR获得超抗原SEA基因片段 ,DNA测序结果与文献报道一致 ;构建了pRSET SEA表达质粒 ,并成功地诱导表达出32 0 0 0u的蛋白 ;Westernblot鉴定所得蛋白能够与SEA单克隆抗体特异性结合。结论 本研究成功地克隆了SEA全长 ,并进行了原核表达和分离、纯化 ,获得了SEA蛋白。
- 叶菁隋延仿李增山陈广生张秀敏曹云新
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A超抗原原核表达PCR
- 肝细胞癌HLA-DR抗原的研究及意义
- 1999年
- 目的:探讨人白细胞DR抗原(HLA-DR)在人原发性肝细胞癌(简称肝癌)的表达情况及其意义.方法:分别采用免疫组化ABC法和流式细胞仪检测了HLA-DR在46例人肝癌组织和4种培养的人肝癌细胞系(SMMC-7721、HCC-9204、BEL-7402和HHCC)的表达情况.结果:39.1%(18/46例)的肝癌组织癌细胞可表达HLA-DR,而在癌旁非肿瘤细胞为阴性.4种肝癌细胞系都基本上不表达HLA-DR.结论:肝癌组织可在一定程度上表达HLA-DR,但是培养的肝癌细胞系基本上不表达.HLA-DR与肝癌发生、发展的关系及其在抗肝癌免疫应答中的作用有待进一步研究.
- 杨连君隋延仿陈志南
- 关键词：肝细胞癌HLA-DR抗原人白细胞DR抗原免疫组织流式细胞仪抗体
- 单克隆抗体导向的超抗原葡萄球菌肠毒素A抗肝癌实验研究被引量：4
- 1999年
- 目的:制备超抗原(SAg)葡萄球菌汤毒素A(SEA)与搞人肝细胞癌单克隆抗体(McAb)F(ab’)_2段的结合物,并观察其介导外周皿单个核细胞(PBAMC)的抗人肝癌作用,方法:提取McAb HAbl8,用木瓜蛋日酶制取其F(ab’)_2段,再用N-琥珀酰亚氨基-3-(2二硫吡啶)丙酸酯(SPDP)制备HAb18 F(ab’)_2-SEA结合物;经凝胶色谱柱纯化后用SDS-PAGE鉴定各收集峰,免疫组化ABC法鉴定此结合物的抗体活性,MTT法观察HAb18 F(ab’)_2SEA介导PBMC的抗肝癌作用.结果:成功地制备了HAb18 F(ab’)_2-SEA结合物,并且此结合物具有明显的介导PBMC靶向杀伤肝癌细胞的作用,并与其剂量呈正相关.对照组无此作用结论:MCAb与SAg结合物导向治疗肝癌是一种有发表前景的肝癌免疫治疗模式.
- 杨连君隋延仿陈志南
- 关键词：超抗原SEA
- 肝癌靶向性超抗原基因疫苗的设计和预测被引量：6
- 2003年
- 目的 :探讨AFP顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原疫苗 (SEA(D2 2 7A) Linker CD80tm)设计的合理性。方法 :应用核酸和蛋白质分析软件GeneConstructionKit2 .0、ANTHERPRO5 .0、JAMBW1 1和www .expasy .com网站提供的方案 ,分析重组体的开放读框以及融合蛋白的可及性、柔性、抗原性和疏水性 ,并作了跨膜区和二级结构模拟。结果 :重组体的转录受AFP顺式作用元件调控 ,Linker所在部位柔性高 ,可及性弱 ,不改变两侧蛋白分子的抗原性和疏水性。融合蛋白表达后 ,被CD80tm锚定于肝癌细胞表面 ,超抗原部分 (SEA)表达在细胞膜外 ,二级结构预测Linker不改变蛋白结构 ,完全符合作者设计疫苗的初衷。结论 :重组疫苗设计合理 ,特异性高 ,融合蛋白有很大可能保留了SEA和CD80tm的理化特性 ,为进一步的实践操作提供了可靠的理论基础。
- 禄韶英隋延仿李增山潘承恩武文叶菁
- 关键词：肝癌
- 重组人CD80-SEA毒素逆转录病毒真核表达载体的构建被引量：3
- 2001年
- 李增山隋延仿姜永强雷祚荣尚继栋
- 关键词：肿瘤免疫基因治疗逆转录病毒真核表达载体
- 超抗原SEA(D227A)的构建及其免疫活性鉴定被引量：6
- 2004年
- 目的 构建SEA(D2 2 7A)基因的原核表达载体 ,并进行表达、分离纯化与免疫活性鉴定。方法 采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因 ,通过下游引物上的点突变 ,使SEA基因第 6 80位碱基由A突变为C ,致使SEA成熟蛋白的第 2 2 7位氨基酸残基由天冬氨酸 (GAT)突变为丙氨酸 (GCT) ,构建pGEX SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,在大肠杆菌DH5α中原核表达 ,再通过淋巴细胞增殖实验对其免疫活性进行测定。结果 构建的SEA(D2 2 7A)基因经测序证实与设计的序列一致 ;成功地构建pGEX SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,转化感受态大肠杆菌DH5α ,通过IPTG诱导、GSTrapFF柱分离纯化及凝血酶切除GST后 ,得到Mr 为 2 70 0 0的目的蛋白。淋巴细胞增殖实验显示 ,10 0ng mL重组SEA(D2 2 7A)可明显刺激淋巴细胞增殖。结论 成功地构建了SEA(D2 2 7A)基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到高效表达 ,所得重组SEA(D2 2 7A)能够刺激淋巴细胞增殖 ,但作用与野生型SEA相比较温和。该结果为寻找有效、毒副作用低的超抗原提供了线索。
- 宋宏萍隋延仿叶菁李增山陈广生张秀敏
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A超抗原原核表达点突变
- 肝癌靶向性超抗原表达载体的构建与鉴定被引量：3
- 2003年
- 目的 设计并构建受AFP基因顺式作用元件调控 ,并经减毒处理的肝癌特异性超抗原表达载体。方法 用新设计的引物作PCR扩增截短的AFP基因启动子和增强子、linker CD80tm和SEA(D2 2 7A)。将上述片断与逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点连接 ,构建成为AFP基因顺式作用元件调控的肝癌特异性减毒超抗原表达载体 [pLXSNSEA(D2 2 7A) Linker CD80tm],并用软件对其开放读框进行分析。结果 成功克隆了截短的AFP基因启动子、增强子、linker CD80tm和SEA(D2 2 7A)。将上述序列连接到逆转录病毒载体pLXSN的多克隆位点 ,酶切鉴定和DNA序列分析无误。结论 AFP基因转录启动元件修饰的SEA表达载体 ,在基因转录水平定量、定向、特异性调控强有力的细胞和体液免疫活化剂 (SEA) 。
- 禄韶英隋延仿李增山潘承恩武文叶菁
- 关键词：肝癌超抗原甲胎蛋白
- 点突变SEA(D227A)的基因构建、原核表达与鉴定被引量：1
- 2004年
- 目的 :进行点突变的SEA(D2 2 7A)基因原核表达载体的构建 ,并进行表达、分离纯化与鉴定。方法 :采用PCR技术从产SEA的葡萄球菌标准株中克隆SEA基因 ,通过下游引物上的点突变 ,使得到的SEA基因 75 2位碱基突变由A突变为C ,致使SEA成熟蛋白的第 2 2 7位氨基酸残基由D(GAT)突变为A(GCT) ,构建pRSET SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中进行原核表达 ,再通过Westernblot进行鉴定。结果 :构建的SEA(D2 2 7A)基因经测序证实与设计的序列一致。成功地构建pRSET SEA(D2 2 7A)重组表达质粒 ,转化感受态大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS ,通过IPTG诱导得到分子量约为 32kD的蛋白 ,Westernblot显示其能够与抗SEA的单克隆抗体特异性结合 ,最后采用Ni2 + NTA柱进行分离纯化。结论 :成功地构建SEA(D2 2 7A)基因原核表达载体 ,并在大肠杆菌中得到高效表达 。
- 叶菁隋延仿陈广生李增山张秀敏曹云新
- 关键词：葡萄球菌肠毒素A超抗原原核表达点突变
- 人CD80-Linker-SEA重组毒素的设计及生物学特性预测被引量：5
- 2001年
- 目的 :构建人重组CD80 Linker SEA毒素的真核表达载体并预测Linker的合理性和可行性。方法 :应用核酸和蛋白质序列分析软件GolgKey对融合基因及Linker部位翻译后在二级结构水平上的一些生物学特性 ,诸如柔性、抗原性、亲水性及表位等加以预测。结果 :CD80 Linker SEA融合基因的氨基酸序列经软件分析 ,并分别与CD80和SEA单独的分析结果相比较 ,发现在二级结构的水平未出现新的抗原性 ,同时在Linker部位具有很低的抗原性 ,亲水性没有改变 ,Linker部位呈中性 ,CD80和SEA具有原来各自的表位特征 ,无新的表位出现。结论 :本研究通过计算机软件对CD80 Linker SEA融合蛋白的预测 ,并与CD80、SEA各加以对比分析和比较 ,以利于在重组过程中有一个合理的设计 。
- 李增山隋延仿姜永强雷祚荣尚继栋
- 关键词：生物学特性
- CD80-SEA重组毒素的设计及二级结构特征的预测被引量：1
- 2000年
- 李增山隋延仿姜永强雷祚荣尚继栋
- 关键词：融合基因
