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细胞核抗原Sm B′的基因克隆和原核表达: 2006年; 目的为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B′。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B′全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEx-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B′抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B′,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。; 杨湘越兰小鹏廖剑钟智强朱忠勇; 关键词：核抗原克隆融合基因

人SmithD1抗原在原核细胞中的表达与纯化及临床应用被引量：2: 2007年; 目的获得人 Smith D1(Sm D1)抗原基因,并进行原核表达及建立斑点免疫金渗虑(dot immunogold filtration assay,DIGFA)检测方法。方法采用基因工程技术,通过 PCR 从人白血病HL-60细胞 cDNA 文库中扩增人 Sm D1抗原基因,构建 pGEX-ST-Sm D1重组表达载体,在大肠杆菌BE21中通过异丙基硫代半乳糖苷酶(IPTG)诱导表达 Sm D1蛋白。利用初步纯化的 Sm D1抗原建立DIGFA。结果重组质粒测序和酶切结果显示 Sm D1抗原基因正确插入 pGEX-5T,重组蛋白、复性及纯化产物经12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),在相对分子质量为39 000处有一明显的蛋白表达条带,免疫印迹法分析表明,重组蛋白具有人 Sm D1抗原的抗原性。DIGFA 与色疫印迹法检测结果的差异无统计学意义(P>0.05),二者的符合率为91.7%。DIGFA 敏感度为100%,特异度为83.3%结论通过基因工程技术制备获得初步纯化的谷胱苷肽转移酶(GST)-Sm D1融合蛋白,用该抗原建立的 DIGFA 与免疫印迹法相似,且具有快速、简便和可靠等优点。; 吴文冰兰小鹏杨湘越; 关键词：克隆原核表达 SM

人自身抗原SSA52的酵母重组分泌表达及其斑点免疫金渗滤法的建立被引量：1: 2012年; 人自身抗原SSA52通常采用组织提取法或原核表达获得,存在诸多问题。通过基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人自身抗原SSA52,并建立斑点免疫金渗滤法。采用RT-PCR扩增SSA52基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-SSA52。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blot)鉴定,并建立斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtration assay,DIGFA),进行初步临床应用对比研究。结果显示,RT-PCR产物约为1 400 bp,与预期1 428 bp接近,pPIC9k-SSA52重组阳性克隆测序结果与基因库核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物SSA52的相对分子质量约52 kD。Western blot法证实表达产物具有天然SSA52分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的表达条带。DIGFA与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为95.2%(120/126),阴性符合率为94.0%(47/50),总符合率为94.9%(167/176);两种方法检测结果无统计学显著差异(P>0.05)。说明SSA52在毕赤酵母中分泌表达成功,建立的DIGFA简便、快速、准确。; 杨湘越宋涛兰小鹏; 关键词：自身抗原克隆巴斯德毕赤酵母斑点免疫金渗滤法

Ro52蛋白的分子生物学研究进展被引量：4: 2010年; Ro52蛋白作为靶抗原,存在于多种自身免疫性疾病,如干燥综合征、系统性红斑狼疮、皮肌炎等患者的血清中。Ro52蛋白是TRIM蛋白家族成员(TRIM21),其分子内含有RING-finger、B-box、卷曲螺旋结构域,分别具有不同的生物学功能。Ro52蛋白在免疫防御中的作用日渐为研究者所关注,如Ro52与IgG分子的作用、Ro52作为一种E3泛素连接酶与其他信号分子的作用等。其自身泛素化和广泛的泛素化作用已经在Ro52与干扰素的作用中得到了体现。迄今,Ro52在自身免疫性疾病中的具体致病机制还不清楚。我们尝试通过介绍Ro52的分子生物学特点及其与相关活性分子的相互作用的最新研究进展,初步探索其可能的致病机制。; 宋涛兰小鹏; 关键词：泛素化分子生物学

人干燥综合征B抗原在巴斯德毕赤酵母菌中的高效分泌表达研究被引量：6: 2006年; 目的：通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母菌中表达人干燥综合征B（SS—B）抗原。方法：PCR扩增SS—B基因，与酵母菌表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—SS—B。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和免疫酶斑点法鉴定。结果：PCR产物约为1200bp，与预期1224bp接近；pPIC9k—SS-B重组阳性克隆测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确。表达产物SS-B的相对分子质量约48000，高拷贝毕赤酵母菌转化菌显著高于低拷贝的表达水平，表达量占分泌总蛋白的60％以上，产物浓度为800～900mg／L。免疫酶斑点法证实表达产物具有天然SS—B分子的免疫原性。阴性对照菌未见目的表达条带。结论：SS—B存巴斯德毕赤酵母菌中获得高效分泌表达，为下一步研究打下了基础。; 杨湘越兰小鹏吴文冰冯福英廖剑朱忠勇; 关键词：克隆表达

狼疮La蛋白的分子生物学研究进展被引量：1: 2009年; 狼疮La蛋白,又叫La核糖核蛋白、La自身抗原或干燥综合征B型抗原,是原发性干燥综合征的特异性自身抗原之一。La蛋白拥有多种结构和运输元件,可定位于不同的亚细胞部位与RNA相互作用。通常La蛋白主要存在于细胞核内,作为RNA聚合酶Ⅲ的转录因子,与RNA聚合酶Ⅲ转录新生产物结合,调节其转录终止,在转录后发挥分子伴侣作用,稳定RNA前体并促进其正确折叠,帮助其进行加工处理。La蛋白还可以与一类拥有内部核糖体进入位点的细胞内mRNA和病毒RNA结合,调节这类RNA的表达翻译;也可在细胞凋亡时被颗粒酶B酶解,产生特异性酶解片段,诱导特异性抗La自身抗体和干燥综合征的生成。我们就La蛋白的分子生物学方面的近期研究进展进行综述。; 徐秀云杨湘越兰小鹏; 关键词：自身抗原

人自身抗原U1RNP 70K的酵母重组分泌表达及斑点免疫金渗滤检测法的建立被引量：1: 2011年; 目的人自身抗原U1RNP 70K通常采用组织提取法或原核表达获得。文中用基因克隆技术,在毕赤酵母中表达人U1RNP 70K自身抗原,并建立斑点免疫金渗滤检测法。方法 PCR扩增U1RNP 70K基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-U1RNP 70K。用电穿孔法转化酵母菌SMD1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western b lot)鉴定。用所表达的蛋白包被硝酸纤维素膜,建立检测U1RNP抗体的斑点免疫金渗滤法(dot immuogold filtrationassay,D IGFA)。结果 PCR产物约为1300 bp,接近于预期的1314 bp,pPIC9k-U1RNP 70K重组阳性克隆测序结果与Gen-Bank中的U1RNP 70K序列完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物U1RNP 70K的相对分子质量约70 000。W estern b lot证实表达产物具有天然U1RNP 70K分子的免疫原性,阴性对照菌无目的条带表达。D IGFA的检测结果与欧蒙酶免疫斑点法的阳性符合率为94.74%(54/57),阴性符合率为98.00%(49/50),总符合率为96.26%(103/107)。2种方法检测结果无统计学显著差异(P=0.617)。结论在毕赤酵母中成功地高分泌表达了U1RNP 70K蛋白,并建立了简便、快速、准确检测U1RNP抗体的DIGFA方法。; 杨湘越张惠菊徐秀云兰小鹏朱忠勇; 关键词：自身抗原克隆巴斯德毕赤酵母斑点免疫金渗滤法

SSA抗原真核表达载体的构建被引量：1: 2008年; 目的:通过基因克隆构建表达人干燥综合征抗原A(SSA)的巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体。方法:从人白血病淋巴细胞HL-60株中提取RNA,反转录出cDNA,然后以cDNA为模板,通过PCR法扩增目的基因SSA,经纯化、双酶切、DNA浓缩回收,插入到酵母分泌型表达载体pPIC9k,用热冲击法转化感受态细胞DH5α,筛选阳性克隆提取质粒,双酶切鉴定并测序。结果:PCR产物大小符合要求,重组质粒pPIC9k-SSA双酶切鉴定与预期一致,测序结果正确。结论:成功构建SSA毕赤酵母分泌型表达载体,为今后获取高纯度、高产量的SSA抗原,研制新型抗SSA诊断试剂盒作前期准备。; 郑宗富兰小鹏杨湘越苏东辉

Smith抗原的性质特征及临床意义: 2007年; 系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫性疾病,患者血清中可检出多种自身抗体,但抗Sm ith(Sm)抗体是SLE的标记性抗体。作者就Sm抗原的理化特性、生物学作用和抗Sm抗体的检测作一综述。; 吴文冰兰小鹏; 关键词：系统性红斑狼疮理化特性生物学作用

人自身抗原Sm B′基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达被引量：2: 2008年; 目的通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原Sm B′。方法PCR扩增Sm B′基因，与酵母表达载体pPIC9k重组，构建表达质粒pPIC9k—Sm B′。用电穿孔法转化酵母菌Sm D1168，在MD平板上筛选重组克隆，用G418快速筛选高拷贝转化子，阳性克隆经甲醇诱导表达后，培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和蛋白质印迹法（WB）鉴定，并用免疫酶斑点法和免疫印迹法（immunoblot，IBT）检测与评价分析30例系统性红斑狼疮（SLE）患者、30例混合结缔组织病患者和30名健康体检者血清中抗-Sm B′水平差异。结果PCR产物约700bp，与预期657bp接近，pPIC9k—Sm B′重组阳性克隆测序结果与核酸数据库报道完全一致，双酶切鉴定正确，表达产物Sm B′的相对分子质量约32000，WB法证实表达产物具有天然Sm B′分子的免疫原性，阴性对照菌未见目的表达条带。免疫酶斑点法检测阳性率为46．7％（42／90），IBT的检测阳性率为51．1％（46／90）；2种方法检测结果一致性较佳（Kappa值=0．9112，P〈0．01）。结论Sm B′在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功，这为Sm B′试剂盒研究奠定了基础。; 杨湘越兰小鹏冯福英吴文冰朱忠勇; 关键词：毕赤酵母自身抗原免疫酶技术

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福建省农科院青年科技人才创新基金(2002J060)

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