上海市科技兴农重点攻关项目(10-1)
- 作品数：3 被引量：10H指数：2
- 相关作者：赵艳敏刘惠莉唐思静马勋邢继兰更多>>
- 相关机构：上海市农业科学院石河子大学巴音郭楞职业技术学院更多>>
- 发文基金：上海市科技兴农重点攻关项目更多>>
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- 大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的原核表达及其活性研究被引量：6
- 2012年
- 为使大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,本实验通过PCR和重叠-延伸PCR扩增,制备了突变体LTR72/G192的基因片段,经酶切和测序结果表明构建的表达载体pLTR72/G192阅读框架正确,而且相应位点氨基酸获得了替换。IPTG诱导表达目的蛋白经SDS-PAGE电泳检测,表达出突变体重组蛋白为约30 ku和10 ku的两个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量相吻合。Western blot检测结果表明两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应。目的蛋白经纯化后进行ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,突变重组蛋白与野生型LT相比其酶活性和毒性均明显降低。纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡,ELISA结果显示,突变体LTR72/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高滴度的抗新城疫病毒的IgG和IgA。
- 唐思静刘惠莉马勋赵艳敏
- 关键词：免疫原性
- 大肠埃希菌不耐热肠毒素双突变体的表达及活性研究被引量：1
- 2014年
- 为了使大肠埃希菌不耐热肠毒素(LT)的毒性丧失或减弱的同时仍保留其较强的免疫原性,通过PCR和重叠—延伸PCR扩增突变体LTK63/G192基因片段,IPTG诱导表达目的蛋白,经Western免疫印迹检测目的蛋白,在HPLC系统上纯化目的蛋白,经ADP-核酸转移酶试验及Patent-mouse毒性试验检测其酶活性与毒性,纯化的目的蛋白与鸡新城疫病毒弱毒疫苗联合一起经滴鼻免疫鸡。结果表明:制备的突变体LTK63/G192的基因片段经酶切和测序发现,所构建的表达载体pLTK63/G192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换;经SDS-PAGE电泳检测,野生型LT及双突变体均表达出约33.0ku和13.0ku的两条蛋白带,与LTA、LTB亚基分子质量相吻合;经Western bolt检测,两个蛋白亚基均可与His抗体发生特异性反应;双突变蛋白的酶活性和毒性与野生型LT相比酶活性和毒性都有所降低;突变体LTK63/G192能辅助新城疫疫苗在血清和黏膜中产生较高抗新城疫病毒的IgG和IgA。说明LTK63/G192是一个良好的免疫佐剂。
- 唐思静姜云吕转平刘惠莉马勋赵艳敏
- 关键词：免疫原性
- 大肠杆菌不耐热肠毒素突变体的表达及活性研究被引量：3
- 2008年
- 利用重叠延伸PCR扩增技术,体外获得大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)突变体LTK63、LTR72和LTG192全基因片段,酶切和测序结果表明构建的表达载体pET30a-LT、pET30a-LTK63、pET30a-LTR72、pET30a-LTG192阅读框架正确,且相应位点氨基酸获得了替换。诱导表达产物用SDS-PAGE检测,野生型LT蛋白及3个突变体均表达出约33.0Ku和13.0Ku的2个蛋白带,与LTA、LTB亚基分子量大小相吻合;Westernblot检测,2个蛋白带均可与抗His抗体发生特异性免疫反应,而13.0Ku的蛋白带还可与抗霍乱毒素(CT)抗体发生免疫学反应。ADP-核糖转移酶活性试验分析,各突变体蛋白酶活性均低于野生型LT蛋白,但仍保留一些酶活性。Patent-mouse毒性试验检测,LTK63、LTR72和LTG192突变体蛋白的毒性均有不同程度降低,LTK63毒性降低最显著,LTG192蛋白毒性相对较大。
- 赵艳敏刘惠莉邢继兰潘洁曹祥荣
- 关键词：突变体
