广州市科技计划项目(2001-Z-035-01-1)
- 作品数：5 被引量：18H指数：3
- 相关作者：姜勇邓鹏刘志锋李海玉郭爱华更多>>
- 相关机构：南方医科大学更多>>
- 发文基金：广东省科技计划工业攻关项目广东省自然科学基金广州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 一种用于穿透多肽筛选的随机文库的构建及筛选被引量：2
- 2006年
- 以增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,EGFP)为示踪物,在pET-14b载体上构建编码12个氨基酸的随机多肽表达文库.建立一种简便、经济、有效的文库筛选方法,从所构建的文库中筛选出细胞穿透多肽(cell-penetratingpeptide,CPP).采用点突变技术,首先在pET-14b载体多克隆位点NdeⅠ和XhoⅠ之间加入4个限制性内切酶位点,随后在BamHⅠ位点后加入三联终止密码子,接着再利用亚克隆的方法在KpnⅠ和XhoⅠ之间插入EGFP,形成一个新的用于原核表达示踪蛋白的载体pET-14bMCStop/EGFP.最后再利用点突变技术在上述构建的示踪载体的多克隆位点XhoⅠ和BamHⅠ之间插入36个随机碱基序列.以His-Tat-EGFP作为工具建立有效的筛选方法,利用这种方法对文库进行筛选.酶切和测序表明,示踪载体的构建是正确的,且在大肠杆菌中可有效地表达出His标记的EGFP.在示踪载体的基础上构建的随机多肽文库至少包含了105个独立克隆,其中90%以上的克隆插入的随机片段都是36个碱基.建立的筛选方法是可行的,并用此方法进行了初步的筛选.
- 刘瑜刘亚伟李海玉刘靖华邓鹏姜勇
- 关键词：跨膜转运内化
- 一种基于HIV-1TAT蛋白质转导结构域细胞内转导系统的成功改建被引量：8
- 2006年
- 目的探索本室构建的pET14b-His-TAT-Flag重组载体表达的融合蛋白在细胞中转导效率低的原因,建立高效的细胞内转导系统。方法通过PCR方法去除原有载体中的Flag序列,在改建正确的pET14b-His-TAT重组载体基础上插入EGFP编码序列,将经酶切、DNA测序鉴定正确的pET14b-His-TAT-EGFP质粒转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导表达、SDS-PAGE鉴定正确,再经蛋白透析、过滤处理。将His-TAT-EGFP融合蛋白加入ECV304细胞中,用荧光显微镜观察。结果重组质粒pET14b-His-TAT融合表达载体和pET14b-His-TAT-EGFP重组载体经酶切、DNA测序鉴定证实构建成功。表达纯化出了高纯度His-TAT-EGFP融合蛋白并具有较高细胞内转导活性。结论成功改建pET14b-His-TAT-Flag重组载体,正确构建pET14b-His-TAT-EGFP载体,His-TAT-EGFP融合蛋白高效表达,并具有明确的细胞内转导活性。
- 郭爱华刘志锋孙学刚李海玉邓鹏姜勇
- 关键词：融合蛋白
- 人IP-10启动子的克隆和转录活性的检测被引量：3
- 2006年
- 目的克隆干扰素诱导蛋白10(IP-10)5′非编码区(NCR)片段,检测克隆的IP-10启动子驱动的荧光素酶报告基因在LPS激活的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的转录活性。方法提取人外周血淋巴细胞基因组DNA,以其为模板,利用巢式PCR扩增人IP-10启动子片段,测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3;将重组质粒pGL3/IP-10P导入HUVEC细胞,检测LPS刺激下荧光素酶活性。结果正确克隆出人IP-10启动子(-2028^-1)片段,成功构建了pGL3/IP-10P报告基因表达载体;证实了LPS可诱导HUVEC细胞中IP-10的高表达。结论成功克隆出人的IP-10启动子片段,并利用荧光素报告基因证实了在HUVEC细胞中LPS可诱导IP-10高转录表达,为深入研究LPS诱导IP-10转录表达的调控机制提供了基础。
- 邵紫韫刘志锋彭毅邓鹏姜勇
- 关键词：干扰素诱导蛋白10脂多糖类
- 细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究被引量：2
- 2006年
- 目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(NLS)序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行Westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。
- 李海玉郭爱华刘志锋刘瑜刘靖华邓鹏李志杰刘亚伟姜勇
- 关键词：细胞穿透肽增强型绿色荧光蛋白核定位信号蛋白转导内化
- 晚期糖基化终末产物受体真核表达载体的构建与表达被引量：3
- 2007年
- 目的构建带HA标签的晚期糖基化终末产物受体真核细胞表达载体。方法采用PCR方法从人cDNA文库中扩增RAGE基因编码区,使用常规酶切、连接方法将其重组至pcDNA3真核表达载体中,对阳性克隆进行酶切、PCR和测序鉴定。以RAGE/pcDNA3重组质粒为模板,运用突变方法在RAGE氨基末端信号肽后插入HA序列。利用Western blotting在HEK293细胞中对经过测序鉴定的HA-RAGE\pcDNA3重组质粒的表达进行了检测。结果RAGE/pcDNA3重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确无误,HA-RAGE\pcDNA3重组质粒可在HEK293细胞中表达。结论成功构建了带HA标签的RAGE真核细胞表达载体,该载体能在真核细胞中表达,为进一步研究RAGE在细胞信号转导途径中的作用提供了一个重要的工具。
- 李煜生龚小卫程蔚蔚魏洁姜勇
- 关键词：RAGE基因表达
