国家自然科学基金(30672107)
- 作品数：15 被引量：18H指数：2
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- CpG寡聚脱氧核苷酸增强树突状细胞疫苗诱导的特异性抗前列腺癌作用被引量：2
- 2011年
- 目的观察CpG寡聚脱氧核苷酸（CpG-ODN）对截短的人前列腺特异性膜抗原（tPSMA）基因修饰的树突状细胞（DCs）诱导的抗前列腺癌效应。方法利用复制缺陷性腺病毒AdEasy-1系统，通过基因重组技术构建Ad—tPSMA及Ad—eGFP。将Ad-tPSMA和Ad．eGFP感染鼠源性DCs，用含10μg／L粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、白细胞介素（IL）-4和含10％胎牛血清（FCS）的RPMI1640培养基诱导培养6d后，然后再添加1mg／L的CpG—ODN体外培养1d，最后添加1mg／L的脂多糖（LPS）继续培养1d，使其成熟。流式细胞仪检测DCs细胞表型，CCK-8法检测混合淋巴细胞反应T细胞增殖能力，酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒检测T细胞分泌细胞因子[IL-2、干扰素（INF）-γ]的影响，CCK-8试剂检测T细胞特性杀伤靶细胞活性。结果CpG．ODN促进Ad—tPSMA感染的DCs（CpG／DCs-Ad—tPSMA）高表达MHCII（83．8±3．7）％、CD80（79．8±5．6）％和CD86（78．3±2．8）％，且刺激同种异体T细胞增殖能力明显高于DCs—Ad—tPSMA组、DCs—Ad—eGFP组和未转染的DCs组（P〈0．05）；培养上清中细胞因子IL-2（179．64±2．72）ng／L和INF．1（1581．75±28．61）ng／L，表达水平均明显高于DCs—Ad—tPSMA组、DCs．Ad．eGFP组和未转染的DCs组（P〈0．05）；CpG／DCs—Ad—tPSMA组诱导RM-1-tPSMA细胞特异性杀伤率为（55．3±1．2）％，明显高于DCs—Ad—tPSMA组（40．7±1．4）％、DCs—Ad—eGFP组（12．7±1．2）％和未转染的DCs组（10．8±1．7）％（P〈0．05）。结论CpG—ODN能增强PSMA基因修饰的DCs疫苗诱导的特异性抗前列腺癌效应。
- 胡建新匡幼林翁小东陈志远祝恒成江波涛刘修恒
- 关键词：前列腺癌树突状细胞CPG寡聚脱氧核苷酸
- 4-1BBL重组腺病毒载体的构建及表达
- 2010年
- 目的构建4-1BBL基因重组腺病毒载体,为前列腺癌的免疫治疗奠定基础。方法以质粒pcDNA3-m4-1BBL为模板,PCR法扩增出4-1BBL cDNA,并将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV-m4-1BBL,经PmeⅠ酶切线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共转化大肠杆菌BJ5183,挑选同源重组质粒,PacⅠ酶切线性化后,转染HEK293细胞包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达,RT-PCR和Western blot法检测4-1BBL表达。结果目的基因经酶切分析,测序鉴定正确,RT-PCR和Western blot证实4-1BBL表达。结论成功构建了含4-1BBL基因的腺病毒载体,该载体可用于前列腺癌的免疫治疗。
- 陈国晓匡幼林翁小东陈志远祝恒成江波涛刘修恒
- 关键词：4-1BBL重组腺病毒基因治疗
- 人前列腺特异性膜抗原胞外区基因重组腺病毒的构建被引量：1
- 2010年
- 目的:体外构建和表达人前列腺特异性膜抗原胞外区(tPSMA)基因重组腺病毒。方法:首先设计一对含BglⅡ和HindⅢ酶切位点的tPSMA引物,以质粒pCR3.1-Uni-hPSMA为模板,通过PCR扩增tPSMA并克隆到腺病毒穿梭质粒中,获得pAdTrack-CMV-tPSMA质粒,将其与含有pAdeasy-1的BJ5183菌电转化,筛选阳性克隆,重组子经线性化后转染HEK293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达、RT-PCR、Western blot法检测目的基因tPSMA的表达。结果:成功构建了含tPSMA的重组腺病毒载体Ad-tPSMA,病毒滴度为2.0×1011pfu/L。结论:该重组腺病毒的构建为下一步研究用其制备树突状细胞疫苗基因治疗提供基础。
- 匡幼林刘修恒祝恒成翁小东陈志远江波涛陈晖刘东山沈昊
- 关键词：前列腺特异性膜抗原基因表达腺病毒
- DIM联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对前列腺癌细胞的抑制作用被引量：2
- 2010年
- 目的探讨3,3-二吲哚基甲烷(DIM)联合肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对前列腺癌细胞的抑制作用。方法CCK-8法测定DIM、TRAIL及DIM联合TRAIL作用于PC-3细胞后的细胞生存率,同时用流式细胞术测定细胞凋亡率,Western印迹检测caspase-3表达水平的变化。结果各给药组与对照组比较均能不同程度抑制PC-3细胞增殖并诱导其凋亡,且caspase-3表达上调;DIM与TRAIL联用明显增强诱导凋亡作用。结论DIM与TRAIL联用均可明显增强PC-3细胞抑制效果和诱导凋亡作用,其凋亡作用机制可能与其上调caspase-3表达有关。
- 匡幼林翁小东陈志远刘修恒祝恒成江波涛
- 关键词：前列腺癌肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体细胞凋亡
- 前列腺癌基因治疗的研究进展被引量：1
- 2011年
- 沈昊匡幼林刘修恒
- 关键词：前列腺癌基因治疗
- 前列腺特异性膜抗原和4-1BB配体共表达基因疫苗诱导的抗肿瘤作用
- 2011年
- 目的探讨小鼠4-1BB配体（m4-1BBL）对截短的人前列腺特异性膜抗原（tPSMA）基因疫苗诱导的抗肿瘤作用。方法构建携带tPSMA和m4—1BBI。基因的真核表达载体pDC316-tPSMAIRES-m4—1BBL，以及编码tPSMA的对照载体pDC316-tPSMA和空载体pDC316。3种质粒分别于C57BL／6小鼠股四头肌内接种免疫，CCK-8试剂盒检测小鼠脾细胞体外特异性杀伤前列腺癌细胞株RM1-tPSMA的活性，观察小鼠体内肿瘤生长变化。结果pDC316tPSMA—IRES-m4—1BBI。疫苗诱导增强的靶细胞特异性杀伤率为42．62％，pDC316-tPSMA组为24．81％，pDC316组为10．81％，组间杀伤率比较差异有统计学意义（P〈0．05）。pDC316疫苗免疫小鼠7d成瘤，瘤体积2657．4mm^3；pDC316-tPSMA组9d成瘤，瘤体积1334．5mm^3；pDC316-tPSMA—IRES-m4—1BBL组12d成瘤，瘤体积445．8mm^3；组间瘤体大小比较差异有统计学意义（P〈0．05）。结论共表达tPSMA和m4-1BBL的基因疫苗能显著增强小鼠抗前列腺肿瘤作用。
- 匡幼林翁小东刘修恒陈志远祝恒成陈晖江波涛
- 关键词：前列腺肿瘤4-1BB配体疫苗
- 特异性小干扰RNA下调中期因子基因表达对膀胱癌细胞化疗敏感性的影响被引量：3
- 2010年
- 目的 观察中期因子（MK）基因小干扰RNA（siRNA）对膀胱癌细胞化疗药物敏感性的影响.方法 设计合成3个MK siRNA,转染人膀胱癌RT4细胞株,定量RT-PCR方法筛选下调MK mRNA效果最好的siRNA;以该siRNA转染RT4细胞后分组：空白对照组（Con-A）、空载对照组（Con-B）、错配对照组及MK siRNA 3.125、6.25、12.50、25.00、50.00、100.00、200.00 nmol/L组,实时定量RT-PCR和蛋白质印迹方法检测各组细胞MK表达情况;噻唑盐法检测紫杉醇（PTX）对各组细胞生长的影响;通过检测caspase-3活性和TUNEL方法观察癌细胞凋亡情况.结果 3个siRNA均明显下调MK mRNA水平,以S3效果最好.PTX组、Con-A十PTX组、Con-B＋PTX组、siRNA 12.50 nmol/L组、3.125 nmol/L＋PTX组、siRNA 6.25 nmol/L＋PTX组、siRNA 12.50nmol/L＋PTX组肿瘤细胞抑制率分别为（18.21±0.36）%、（18.19±0.29）%、（17.89±0.33）%、（1.86±0.52）%、（32.56±0.53）%、（53.83±0.38）%、（78.95±0.55）%.TUNEL结果显示,ConA、Con-B、siRNA 3.125、6.25、12.50 nmol/L组凋亡指数分别为（1.81±0.36）%、（1.89±0.38）%、（5.56±0.58）%、（9.68±0.55）%和（15.25±0.56）%.结果 MK基因siRNA可增强膀胱癌细胞化疗敏感性,诱导凋亡是其重要机制之一.
- 范钰顾晓唐孝达
- 关键词：膀胱肿瘤化疗敏感性
- 小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达
- 2009年
- 目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。
- 冯正秋刘修恒江波涛翁小东匡幼林
- 关键词：基因克隆真核表达共刺激分子
- 4-1BBL基因修饰前列腺癌细胞的体内抗肿瘤作用被引量：1
- 2010年
- 目的 观察转染4-1BBL的小鼠前列腺癌细胞株RM-1体内抗肿瘤效应及对免疫功能的影响.方法 用脂质体法将重组质粒pcDNA3和pcDNA3-4-1BBL分别导入小鼠前列腺癌细胞RM-1中,经G418筛选,建立高表达的细胞株.逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和间接免疫荧光法检测4-1BBL的表达.将转染前后的肿瘤细胞,分别接种于C57BL/6小鼠的左肋腹侧皮下观察其致瘤性.CCK-8检测其细胞毒性T淋巴细胞（CTL）杀伤活性.结果 成功建立高表达4-1BBL的RM-1/4-1BBL细胞株.25 d后,RM-1/4-1BBL组小鼠致瘤体积为（730.0±23.6）mm3较RM-1/pcDNA3组（1490.0±36.4）mm3和RM-1组（1510.0±26.8）mm3均小（P＜0.05）.接种RM-1/4-1BBL细胞小鼠的CTL细胞杀伤活性为（35.4±1.6）%,较RM-1/pcDNA3组（12.8土2.0）%和RM-1组（13.7±3.6）%均增强（P＜0.05）.结论 4-1BBL基因修饰的小鼠前列腺癌细胞能显著增强小鼠的免疫功能,抑制肿瘤的发展.
- 陈志远匡幼林刘修恒陈晖祝恒威郭佳
- 关键词：前列腺癌肿瘤免疫
- 转染4-1BBL的前列腺癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫作用被引量：1
- 2010年
- 目的:观察转染4-1BBL重组腺病毒载体的小鼠前列腺癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫作用及机制。方法:利用复制缺陷型腺病毒AdEasy-1系统,通过基因重组技术构建Ad-m4-1BBL及Ad-eGFP。将Ad-m4-1BBL和Ad-eGFP感染小鼠前列腺癌细胞RM-1,以丝裂霉素C(MMC)处理,制成肿瘤细胞疫苗(TCV,TCV-Ad-eG-FP,TCV-Ad-m4-1BBL),经体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养,ELISA法检测脾细胞分泌细胞因子(IL-2,INF-γ)的影响,CCK-8试剂检测脾淋巴细胞特异性杀伤活性。结果:转染4-1BBL基因的小鼠前列腺癌细胞瘤苗TCV-Ad-m4-1BBL高表达4-1BBL蛋白,培养上清中细胞因子IL-2[(180.24±2.22)pg/ml]和INF-γ[(1 512.46±23.64)pg/ml]表达水平均明显高于TCV和TCV-Ad-eGFP组(P<0.05),TCV-Ad-m4-1BBL瘤苗诱导RM-1细胞特异性杀伤率[(34.24±2.64)%],相比TCV-Ad-eGFP[(14.65±3.21)%]和TCV[(9.82±1.48)%],差异有显著性(P<0.05)。但针对Hepal-6细胞,3种瘤苗均无效。结论:表达4-1BBL的小鼠前列腺癌细胞瘤苗能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。
- 匡幼林翁小东刘修恒陈志远祝恒成江波涛
- 关键词：4-1BBL肿瘤疫苗共刺激分子前列腺癌
