天津市自然科学基金(05YFJMJC01100)
- 作品数：4 被引量：9H指数：2
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- NK13中(S)-酮基布洛芬拆分用酯酶基因的克隆及表达被引量：4
- 2008年
- 以筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经初步鉴定为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium),通过构建其基因文库,从中筛选得到一阳性克隆重组子pUC-NK。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为933bp的酯酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该酯酶基因属首次发现(GenBank登录号为DQ196347),将此基因克隆到原核表达载体pET21b+中构建重组表达质粒pET-NKest,转化E.coliBL21,经IPTG诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为34kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株的转化效率较原始菌有明显提高,由表达菌45min就能转化酮基布洛芬氯乙酯47.4%,而得到的(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%)由野生菌NK13的5.84%提高到55.46%,提高将近10倍,说明该酯酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。
- 许丽娟谭之磊刘刚孟龙张金红
- 关键词：酯酶克隆
- 拆分获得(R)-酮基布洛芬酯酶基因的筛选、克隆与表达被引量：1
- 2010年
- 以自筛选出的具有一定不对称拆分外消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的野生菌BacillusmegateriumNK13为材料,通过构建其基因文库,筛选得到一个阳性克隆重组子pUC18-NK-HYD3。分析测序结果发现外源片段中包含一段完整的741bp的开放阅读框,其编码的蛋白中含有酯酶的GXSXG保守序列。经在NCBI的BLAST系统中比对,证明该酯酶基因属于首次发现（GenBank Accession Number：GU143552）。将酯酶基因克隆到载体pET21b（＋）中,转化E.coliBL21（DE3）,经IPTG诱导后在宿主菌得到表达。SDS-PAGE电泳检测证明该酯酶蛋白分子量约为28kDa。TLC和HPLC检测结果显示,该酯酶优先水解（R）-型底物,在重组菌菌液体系,转化率为15%时,酯酶拆分获得（R）-酮基布洛芬的过量值（e.e.%）最高,达62.74%;改用重组菌湿菌体的PBS体系后,在转化率为10%50%时,酯酶拆分获得（R）-酮基布洛芬的过量值（e.e.%）一直保持在73%76%之间。
- 刘瑞恩赵运英史斐斐赵玉红许丽娟张金红
- 关键词：酯酶克隆
- 拆分获得(S)-酮基布洛芬脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的克隆与表达被引量：2
- 2010年
- 【目的】筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因,构建其表达分泌型工程菌,并进一步提高该脂肪酶的立体选择性。【方法】以自筛选出的一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的菌株NK13为材料,通过构建其基因组文库,筛选具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯能力的脂肪酶基因。通过构建该脂肪酶基因的分泌型诱导表达载体pHY300-plk-sacR-gene,将其转入枯草芽孢杆菌WB600,获得基因重组菌WB600(pHY300-plk-sacR-gene)。用SDS-PAGE检测其表达和转化情况,采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法纯化脂肪酶;并利用TLC和HPLC检测该酶的立体选择专一性。【结果】得到了具有专一性拆分获得(S)-酮基布洛芬能力、长度为633bp的脂肪酶基因(GenBank登录号为:EU381317)。该脂肪酶在枯草芽孢杆菌WB600中得到了分泌表达。TLC和HPLC检测结果显示,纯化的脂肪酶对底物转化40h时转化率为30%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达60.02%,与未加Tween-80的枯草芽孢杆菌转化子体系相同。而在含Tween-80的环境下,枯草芽孢杆菌表达重组菌对底物转化36h时转化率约为45%,生成(S)-酮基布洛芬的e.e.%值最高,达93.64%,是野生菌NK13的16倍。【结论】从NK13号菌株中筛选得到的新的脂肪酶具有很高的不对称拆分获得(S)-酮基布洛芬的能力,实现了NK13菌中633bp脂肪酶基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达,研究证明Tween-80能提高该脂肪酶的拆分专一性。
- 赵运英刘瑞恩许丽娟史斐斐赵玉红王善韦张金红
- 关键词：脂肪酶手性拆分
- (S)-酮基布洛芬拆分用脂肪酶基因的克隆及表达被引量：3
- 2010年
- 本实验室筛选出一株具有不对称拆分消旋酮基布洛芬氯乙酯的菌株NK13为材料,经鉴定为巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium。通过构建其基因文库,从中筛选得到阳性克隆重组子pUC-NK1。测序分析表明,该重组子质粒中包含一长度为633bp的脂肪酶基因的完整开放阅读框,核苷酸同源性对比证明该脂肪酶基因属首次发现(GenBank Accession No.EU381317),将此基因克隆到原核表达载体pET21b(+)中构建重组表达质粒pET-NKest1,转化Escherichia coli BL21,经Isopropyl-β-D-Thiogalactoside(IPTG)诱导在宿主菌中得到表达,经SDS-PAGE电泳检测证明该脂肪酶成熟蛋白分子量约为20kDa。薄层层析与HPLC检测结果显示,表达菌株转化外消旋酮基布洛芬氯乙酯得到(S)-酮基布洛芬过量(e.e.%),由野生菌NK13的5.84%提高到75.28%,提高约15倍,说明该脂肪酶具有优先拆分得到(S)-酮基布洛芬的特性。
- 许丽娟赵玉红刘瑞恩赵运英张金红
- 关键词：脂肪酶克隆
