广东省自然科学基金(001356)
- 作品数：7 被引量：10H指数：2
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- p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究
- 2010年
- 目的 建立稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中核因子NF-κB（p65）表达的shRNA序列,构建慢病毒载体,检测p65在前列腺癌细胞中的作用功能.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补单链DNA将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中转染前列腺癌细胞,采用RTPCR方法检测不同序列片断对p65 mRNA的抑制效率,免疫印迹方法检测其对p65蛋白表达的抑制效率.将获得的慢病毒载体感染LNCaP细胞,设对照组、空转组.采用MTT、流式细胞术、Transwell等方法检测p65的生物学作用.结果 设计的3条针对p65序列中,第3条序列对前列腺癌细胞株中p65 mRNA的干扰效率为59%,对蛋白表达的抑制率达81%.目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGAT-GACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3＇.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.MTT检测实验组细胞96 h内未出现对数增殖,生长能力低于对照组和空转组.流式细胞检测实验组G0～G1期细胞百分率为61.49%,高于对照组的44.89%和空转组的41.52%;而S期细胞百分率为28.58%,低于对照组的47.36%和空转组的46.10%,差异有统计学意义（P＜0.05）.Transwell检测实验组透过细胞数为（16.5000±6.62076）个,低于对照组和空转组[（45.6333±13.54159）个,（36.8333±5.68412）个],差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株LNCaP中p65表达的shRNA序列,并构建慢病毒载体;初步验证了p65在前列腺癌细胞增殖、侵袭和转移中的促进作用.
- 黄海杜涛黄健林天歆张彩霞董文尹心宝郭正辉许可慰江春韩金利
- 关键词：前列腺肿瘤核因子ΚB
- 前列腺癌患者抗体库构建中抗体基因的扩增被引量：1
- 2005年
- 目的:探讨如何扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础。方法:分离前列腺癌患者外周血淋巴细胞,提取其总RNA,逆转录为cDNA,通过改变PCR反应条件扩增出全部κ、λ轻链及大部分重链Fd段;改变PCR反应条件扩增未成功的重链片段改用半套式PCR进行扩增。结果:不仅所有引物都扩增出产物,而且其产量也较高。结论:这表明改变PCR反应条件与半套式PCR联合应用可扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础。
- 赵风进黄健林天歆黄海许可慰江春韩金利
- 关键词：前列腺癌免疫球蛋白抗体库
- 稳定阻断前列腺癌细胞中p65的shRNA基因序列的获得及蔓病毒载体的构建
- 2010年
- 目的 获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中核因子[NF-κB（p65）]表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.方法 根据p65基因信息,设计siRNA1、siRNA2、siRNA3 3条针对p65基因cds区的siRNA序列,组建shRNA对应的4对互补的单链DNA,包括siRNA的正义链和反义链;正义链序列按5＇向3＇顺序依次为：酶切位点（BamH Ⅰ）、干扰序列（19bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19 bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoR Ⅰ）.将合成的序列插入空载体pSI H1-H1-copGFP shRNA Vector中,转染前列腺癌细胞后,通过real-time聚合酶链反应（PCR）检测不同序列片段对p65的mRNA抑制效果,通过Western blot检测对p65蛋白表达的抑制效果.从而获得可以稳定高效抑制前列腺癌细胞中p65表达的shRNA序列.结果 设计的3条针对p65的序列中第3条的抑制效果最好,目的序列位于p65（NM_021975）的1096～1113,茎环序列为5＇-GATCC GCCCTATCCCTTTACGTCA TTCAAGAGA TGACGTAAAGGGATAGGGC TTTTT G-3＇.其对前列腺癌细胞株中p65的mRNA的干扰效率为59%,对其蛋白表达的抑制率为81%.转染细胞后,细胞可以稳定低表达p65.结论 成功获得稳定阻断前列腺癌细胞株Lncap中p65表达的shRNA序列,并构建蔓病毒载体.
- 郭正辉黄海杜涛林天歆李海源许可慰宁志丰江春韩金利黄健
- 关键词：核因子前列腺癌RNA干扰
- 前列腺癌患者噬菌体抗体库的构建被引量：1
- 2004年
- 【目的】构建前列腺癌患者的噬菌体抗体库,为前列腺癌特异性的人源性抗体Fab片段的筛选及其应用奠定基础。【方法】由前列腺癌患者外周血分离得淋巴细胞,完整提取其总RNA,经RT-PCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链Fd段基因,然后经酶切、纯化、连接等步骤克隆进载体pComb3,并电转化大肠杆菌XL1-Blue,从而构建前列腺癌患者噬菌体抗体库。【结果】成功构建噬菌体抗体Fab片段库,其轻链及重链Fd段与载体DNA的重组率分别为87%、79%,库容为23.2×107,滴度为87×1012mL-1。【结论】本研究成功构建了前列腺癌患者噬菌体抗体库。
- 赵风进黄健林天歆黄海许可慰潘秋辉
- 关键词：前列腺癌噬菌体抗体库肿瘤
- 人前列腺特异性膜抗原cDNA的克隆、原核表达、鉴定和抗原初步纯化被引量：6
- 2004年
- 目的 克隆中国人前列腺特异性膜抗原 (PSMA)cDNA全长 ,构建PSMA原核表达重组子。诱导PSMA原核表达 ,并对表达产物进行初步纯化。 方法 从前列腺癌患者组织中提取总RNA ,利用PSMAcDNA中的EcoRⅠ位点 ,将PSMA分为两段分别作RT PCR ,分别连接到pET 30a中 ,从而得到完整PSMAcDNA的原核表达重组子pET 30a PSMA ,并进行酶切鉴定与序列测定。确定序列正确后 ,利用IPTG诱导重组子表达 ,采用Ni NTAAgarose螯合层析柱对表达产物初步纯化 ,SDS PAGE和Western Blotting对表达产物和纯化产物进行鉴定。 结果 成功克隆到序列完全正确的人源PSMAcDNA ,诱导表达并初步纯化出PSMA蛋白 ,该蛋白具有较好的抗原性和特异性。
- 黄海黄健林天歆许可慰赵风进潘秋辉江春韩金利
- 关键词：膜抗原CDNA克隆原核表达抗原
- 靶向于前列腺癌特异性膜抗原shRNA的筛选与鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中前列腺癌特异性膜抗原（PSMA）表达的shRNA序列。方法根据PSMA基因信息，设计siRNA1、siRNA2、siRNA3三条针对PSMA基因cds区的siRNA序列及无意义的对照序列，组建与之对应的4对互补的单链DNA序列，包括siRNA的正义链和反义链；正义链序列按5’向3’顺序依次为：酶切位点（BamHⅠ）、干扰序列（19bp）、loop环（TTCAAGAGA）、干扰序列的反向互补序列（19bp）、中止信号（TTTTT）、酶切位点（EcoRⅠ）。将合成的序列插入空载体pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector中，转染前列腺癌细胞后，通过real-time PCR检测不同序列片段对PSMA的mRNA抑制效果并通过Western blot检测对目的蛋白PSMA的抑制效果。结果设计的3条针对PSMA的序列中第2条的抑制效果最好，目的序列位于PSMA（NM_0004476）的1207到1226，茎环序列为5’-GATCC GTCTCAAAGTGCCCTACAA TTCAAGAGA TFGTAGGGCACTTTGAGAC TTTTT G-3’。其对前列腺癌细胞株中PSMA的mRNA的抑制率为60．0％，对其蛋白表达的抑制率为86％。转染细胞后，细胞可以稳定低表达PSMA。结论成功获得高效抑制前列腺癌细胞株Lncap中PSMA表达的shRNA序列。
- 郭正辉黄海杜涛许可慰林天歆曾乐祥江春韩金利黄健
- 关键词：前列腺癌RNA干扰抗原
- 前列腺癌噬菌体抗体库的构建及抗特异性膜抗原抗体的筛选被引量：7
- 2007年
- 目的建立国人前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库，筛选、鉴定抗前列腺特异性膜抗原（PSMA）的人源Fab抗体可变区的编码基因，为前列腺癌的诊断与基因治疗研究开辟新途径。方法20例前列腺癌患者外周血分离淋巴细胞，提取其总RNA，经RTPCR及半套式扩增得到免疫球蛋白全部轻链和重链Fd段基因，克隆进载体pComb3，并电转化大肠杆菌XLl-Blue，构建前列腺癌噬菌体Fab抗体片段库。采用噬菌体表面展示技术，以PSMA原核表达重组子pET30a（＋）-PSMA诱导表达并纯化后的PSMA为固相抗原，从噬菌体Fab抗体库中经过“吸附洗脱扩增”筛选过程，获得抗原结合活性和特异性较强的PSMA人源Fab可变区抗体基因片段的阳性克隆，并进行免疫检测及序列测定。结果成功构建前列腺癌噬菌体抗体Fab片段库，其轻链及重链Fd段与载体DNA的重组率分别为87％、79％，库容为2．32×10^7，滴度为8．7×10^13pfu／ml。筛选得到Fab抗体克隆的Fd段基因核苷酸序列为696bp，编码由232个氨基酸残基组成的多肽，与人免疫球蛋白γ链恒定区的同源性为98％；轻链κ基因核苷酸序列为630bp，编码由210个氨基酸残基组成的多肽，与κ链恒定区同源性为93％。结论成功构建了前列腺癌噬菌体抗体库，并获得了PSMA人Fab抗体可变区编码基因克隆，该克隆抗体基因具有典型的免疫球蛋白轻链和重链可变区的结构特点，基因编码产物具有与PSMA反应的免疫学活性和特异性。
- 黄海黄健林天歆赵风进潘秋辉许可慰郭正辉江春韩金利
- 关键词：噬菌体展示技术前列腺特异性膜抗原前列腺肿瘤噬菌体抗体
