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转基因猪细胞中CMV启动子区域甲基化的研究: 2015年; 为研究转基因猪外源基因表达与启动子区域甲基化的关系,利用流式细胞仪检测体外传代至第5、10和15代的转基因猪成纤维细胞中EGFP荧光强度的变化情况;采用亚硫酸盐测序的方法对这3代细胞CMV IE启动子区域30个Cp G岛的甲基化程度进行测定。结果显示细胞从第5代培养到第10代时荧光变弱,但是当继续培养到15代时EGFP荧光又渐渐变强,但EGFP阳性细胞的比例没有发生变化,均为100%。第5、10、15代细胞启动子区域的Cp G岛甲基化阳性率分别为3.64%±1.25、2.97%±1.03和1.65%±0.74,统计结果表明3代细胞间的甲基化阳性率差异不显著(P>0.05)。表明转基猪成纤维细胞中CMV启动子区域的甲基化程度随着体外培养时间的变化不明显,与EGFP的表达水平变化无明显相关。; 任广彩张英丛佩清陈瑶生何祖勇; 关键词：甲基化启动子 CPG岛转基因猪

利用ZFN敲除转基因猪细胞中多拷贝EGFP基因: 2014年; 锌指核酸酶（zinc finger nuclease,ZFN）是由特异性识别DNA的锌指结构域和Fok I切割结构域组成,能够在基因组特定位点上切割DNA,引起DNA双链断裂（double-strand break,DSB）.通过DSB修复机制,可以使基因修饰的效率比传统方法提高102~104倍.目前,利用ZFN对动物内源基因进行敲除的研究较多,但对转基因动物中外源多拷贝基因进行敲除的报道较少.本研究首先利用荧光定量PCR法对本实验室培育的两头转基因猪中增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的拷贝数进行鉴定,发现其拷贝数分别为11.95和17.36拷贝;然后将靶向EGFP的一对ZFN转染进拷贝数为17.36的EGFP转基因猪的成纤维细胞中,并通过流式和CEL-1酶切方法检测敲除效率.结果表明,转染400 ng、800 ng和1 200 ng ZFN的切割效率分别为0.97%、1.39%和1.76%,可见随着转染ZFN剂量的增加,ZFN的切割效率逐渐提高.但是,不发绿色荧光的细胞比例却没有明显提高,因此认为,ZFN敲除转基因动物中多拷贝基因的效率还是比较低.; 任广彩张英丛佩清陈瑶生何祖勇; 关键词：锌指核酸酶增强型绿色荧光蛋白转基因猪

猪CatSperB和CatSperG基因的克隆、表达及生物信息学被引量：2: 2012年; 【目的】揭示猪CatSperB和CatSperG基因的存在、蛋白的结构特征、进化关系及时空表达特性。【方法】利用电子和分子克隆技术鉴定猪CatSperB和CatSperG基因全长cDNA,并利用定性RT-PCR和荧光定量RT-PCR进行CatSperB和CatSperG基因的时空表达研究。【结果】①分别获得了3 508 bp CatSperB和3 715 bp CatSperG电子转录子,分别包含3 330和3 483 bp开放阅读框,并经TA克隆测序验证,其CDS序列与人、牛、马和狗等的CatSperB和CatSperG基因的序列相似性在80%以上;②CatSperB分子质量为125.79 kD,为稳定蛋白;CatSperG分子质量为133.40 kD,为不稳定蛋白;③CatSperB和CatSperG都包含7个通道蛋白保守的跨膜结构域,CatSperG蛋白C端含一个超螺旋结构,而CatSperB蛋白无明显的超螺旋结构信号;猪CatSperB和CatSperG与牛、狗和马的CatSperB和CatSperG蛋白同源关系较近,与人和小鼠的同源关系较远;④RT-PCR分析表明,CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸中表达,但CatSperB在其它组织也有表达信号;⑤CatSperB和CatSperG基因mRNA表达水平在猪性发育的重要阶段,精子发生(60日龄)、初情期(90日龄)和性成熟(150日龄)前后都有显著提高(P<0.05)。【结论】获得了猪CatSperB和CatSperG基因的cDNA克隆及其一系列生物信息学参数,揭示了CatSperB和CatSperG蛋白含7个保守的跨膜结构域及不同物种间的进化关系,证实CatSperB和CatSperG基因主要在睾丸表达,且其mRNA表达变化与公猪的性发育相一致。; 宋成义周家庆冯晓军谢雨琇李庆平吴晗高波王霄燕; 关键词：克隆

成年克隆巴马小型猪心脏差异蛋白的鉴定与生物信息学分析被引量：1: 2013年; 本研究旨在探索体细胞核移植(克隆)操作对克隆巴马小型猪心脏发育的影响。分别提取3头成年克隆猪和3头繁殖猪的心脏蛋白,利用双向电泳-质谱体系的比较蛋白质组学技术进行分离和鉴定,并结合生物信息学手段对部分差异蛋白进行功能分析。结果表明,与对照猪相比,克隆巴马小型猪的心脏蛋白共有11个差异蛋白,其中5个为上调蛋白,6个为下调蛋白。本试验在蛋白质水平上证实:3头克隆巴马小型猪的心脏均存在一定程度的功能失调。; 张树山戴建军吴彩凤张廷宇张德福; 关键词：巴马小型猪体细胞核移植比较蛋白质组学

不同营养成分对公猪精液品质的影响被引量：7: 2013年; 公猪优良精液的产生与必要的营养供给是密不可分的。为探讨鸡蛋、豆粕、胡萝卜三种营养物质对公猪精液品质的影响,本试验通过评价精液采集量、精子密度、活力及畸形率等指标,来判定其对猪精液的影响。试验表明,公猪日粮中饲喂豆粕和鸡蛋对公猪精液的采集量,活力均有显著的提高;饲喂胡萝卜对公猪精液的采集量,活力无明显差异。为公猪饲养过程中提供一些实际的生产指导。; 朱轶铂渊锡藩宋子仪仇杨史新娥李步社杨公社; 关键词：豆粕鸡蛋胡萝卜公猪精液品质

干扰视黄醇结合蛋白4对猪脂肪细胞PI3K/Akt信号通路的影响被引量：3: 2013年; 视黄醇结合蛋白4(Retinol binding protein 4,RBP4)是一种脂肪细胞分泌因子,其表达水平的升高与胰岛素抵抗及Ⅱ型糖尿病等疾病密切相关,但具体作用机制尚不清楚。为明确此机制,通过包装RBP4干扰慢病毒并侵染猪前体脂肪细胞。运用胰岛素激活及诱导胰岛素抵抗模型,利用QRT-PCR及Western blotting方法检测RBP4的干扰效率及处理组PI3K/Akt信号通路相关基因的表达。结果显示RBP4的基因及蛋白的干扰效率达到60%(P<0.01)以上。进一步研究发现在胰岛素诱导及胰岛素抵抗的情况下,LH1-shRBP4干扰后可显著提高胰岛素信号通路AKT2、PI3K、GLUT4和IRS1基因mRNA的表达;明显促进AKT2、PI3K和IRS1蛋白的磷酸化;提高AKT2、PI3K和GLUT4基因的总蛋白水平。总之,RBP4干扰通过上调PI3K/Akt胰岛素信号通路相关因子的表达及其磷酸化水平,提高了胰岛素敏感性。此研究将为胰岛素抵抗相关疾病的治疗提供新思路。; 蒲蕾程佳吴国芳杨浩仇杨张振宇杨公社孙世铎; 关键词：视黄醇结合蛋白4 慢病毒前体脂肪细胞胰岛素信号通路

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国家科技重大专项(2011ZX08006-005)

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