国家科技基础条件平台建设计划(2005DKA21205-3)
- 作品数：17 被引量：56H指数：5
- 相关作者：刘光远田占成谢俊仁李知新龚真莉更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学沈阳农业大学更多>>
- 发文基金：国家科技基础条件平台建设计划甘肃省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选被引量：1
- 2010年
- 为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。
- 王建科张云德张强吴国华颜新敏朱海霞李健邵长春朱彩珠吴磊
- 关键词：口蹄疫病毒羊痘病毒
- 基于18S rRNA基因测序基础上的锥虫分子分类学被引量：5
- 2009年
- 利用18S rRNA基因序列分析方法，对我国湖北、广西、新疆和浙江4省的伊氏锥虫及1株布氏锥虫进行分子分类学研究。用分离的锥虫感染实验动物，自感染小鼠的红细胞或全血中提取基因组DNA，根据GenBank中已发表的锥虫18S rRNA序列设计1对锥虫通用引物，通过PCR扩增目的基因片段，将扩增产物连接到pGEM—T载体中，经酶切、PCR确定．进行序列测定。结果显示，7个锥虫分离株的18S rRNA基因大小为2188bp。利用DNAStar对试验所获得的这7株堆虫和GenBank中部分锥虫的18S rRNA基因进行比较分析，建立2个进化系统发生树。核苷酸同源性比较及系统发生树显示：自我国上述4省分离的伊氏锥虫来源于同一株系，布氏锥虫和广西分离的伊氏锥虫株的18S rRNA核苷酸与其他锥虫分离株仅有较小差异，与国外的6株锥虫的同源性为99％～100％。与另外7株的同源性为62％。
- 刘光远田占成龚真莉谢俊仁李知新
- 关键词：锥虫RRNA基因
- 含O型FMDVP1-2A、3C基因和EGFP基因表达盒的构建被引量：2
- 2009年
- 采用RT-PCR方法分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,分别得到重组载体pUC119-P1-2A和pMD18-T-3C;将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHⅠ酶切,重组载体pMD18-T-3C用BamHⅠ、NheⅠ酶切;利用酶切所得到的基因片段P1-2A、3C有共同的BamHⅠ酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C.将基因P1-2A-3C与启动EGFP表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C,并进行PCR扩增、酶切鉴定及序列测定.结果表明:试验成功构建了一侧启动表达P1-2A-3C基因,一侧启动表达标记基因EGFP的表达盒p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C.
- 王建科吴国华叶奕优颜新敏朱海霞李健朱彩珠张强王雯慧
- 关键词：FMDV
- 驽巴贝虫病间接ELISA检测方法的建立被引量：9
- 2010年
- 目的克隆表达驽巴贝虫诊断抗原基因BC48,建立间接ELISA诊断方法。方法从感染驽巴贝虫的毛驴血液中提取虫体基因组DNA,利用PCR技术扩增BC48基因,将其克隆入表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌感受态细胞,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍柱亲和层析法纯化蛋白。以该蛋白作为诊断抗原建立间接ELISA诊断方法 ,对反应条件进行优化,并对该方法的特异性和敏感性进行评价。结果扩增获得1272bp的BC48基因片段。重组表达质粒pET-28a-BC48诱导后获得大小约为Mr46000的可溶性融合蛋白,纯化后蛋白浓度为12.98mg/ml。间接ELISA方法条件优化的结果显示,最佳抗原包被浓度为65μg/ml,最适血清稀释度为1∶80,该融合蛋白可特异性地与驽巴贝虫感染血清结合,而不与马泰勒虫感染血清及阴性血清反应。使用该方法与镜检法检测17份散养毛驴血清样品,阳性检出率分别为3/17和2/17。结论以BC48重组蛋白为抗原建立的间接ELISA方法可用于马属动物驽巴贝虫病的检测。
- 龚真莉刘光远谢俊仁柴慧萍张丽艳李知新田占成王路刘建刚
- 关键词：纯化ELISA
- 山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA复制非必需区的筛选被引量：2
- 2007年
- 提取山羊痘病毒温度敏感株基因组DNA，用HindⅢ酶切，随机克隆到pUC18质粒中，限制性内切酶片段电泳分析和序列测定结果表明，克隆到4个不同大小的HindⅢ片段pUA、pUB、pUC和pUD。随后，将它们和羊痘病毒Pellor（AY077835）株进行了同源性比较，发现核苷酸同源性为90。0％～94．5％，氨基酸同源性为83．0％～91．4％。选取克隆或亚克隆后的单一酶切位点，插入P11P7.5-LacZ报告基因，构建了pUAl、pUBl、pUCl和pUDl共4个重组载体质粒。通过脂质体分别转染山羊痘病毒感染的BHK-21细胞，在X-gal存在条件下经蓝白斑筛选重组病毒，获得1株重组病毒，证明筛选出了1个复制非必需区片段。
- 施程洪张强吴国华颜新敏鞠厚斌李健朱海霞朱彩珠谢芳韩若婵才学鹏
- 关键词：山羊痘病毒基因克隆转染
- 长角血蜱卵cDNA表达文库的构建被引量：6
- 2008年
- 【目的】以长角血蜱卵为材料构建高质量的长角血蜱卵cDNA表达文库,为进一步筛选克隆目的基因奠定基础。【方法】在无RNA酶污染的环境下从长角血蜱卵中提取RNA,进而纯化mRNA,采取oligo(dT)引物合成双链cDNA,定向克隆到λSCREEN载体。用PhageMaker extract对其进行体外包装以形成完整的噬菌体,转染大肠杆菌ER1647,测定库容量。并用构建的cDNA文库克隆已知的长角血蜱促卵泡激素基因。【结果】所构建长角血蜱卵cDNA表达文库的基础库容量约为1.38×106PFU,重组率为100%,扩增后文库的滴度为2×109PFU·ml-1。获得了目的基因,其序列与GenBank中的长角血蜱促卵泡激素(DQ248886)的核苷酸序列的同源性为97.8%。【结论】成功构建了长角血蜱卵cDNA表达文库。
- 刘光远田占成才学鹏李知新谢俊仁王路张林龚真莉
- 关键词：长角血蜱CDNA表达文库
- 长角血蜱甘肃株肌钙蛋白基因P27/30的克隆和序列分析被引量：3
- 2007年
- 参照GenBank中长角血蜱致病性Okayama株肌钙蛋白P27/30基因的核苷酸序列,设计合成一对引物,从本实验室保藏的干净长角血蜱卵中快速提取总RNA,通过RT-PCR扩增出607 bp的肌钙蛋白基因,将其克隆于PGEM-T-Easy载体,对其进行序列分析,并推导出氨基酸序列,将这一序列与国内外已发表的长角血蜱肌钙蛋白基因进行比较分析。结果表明本实验室保藏的长角血蜱甘肃株与上述已发表的Okayama株核苷酸序列同源性为92.1%,氨基酸同源性为86%。长角血蜱甘肃株与Okayama株、四川孤雌生殖株的发育有一定差异。经RT-PCR分析表明,该基因在长角血蜱的卵、幼蜱、若蜱和饥饿成蜱这几个阶段均有表达。
- 田占成刘光远李知新谢俊仁王路张林
- 关键词：长角血蜱克隆
- 蜱免疫球蛋白结合蛋白的研究进展被引量：1
- 2008年
- 从蜱与宿主的相互作用、宿主免疫球蛋白-G(IgG)在蜱体内的代谢过程、免疫球蛋白结合蛋白(IGBP)的发现及其在具尾扇头蜱中的功能等方面阐述了IGBP与抗蜱免疫的关系。认为抗蜱疫苗的成功策略或许是"二次联合疫苗",而IGBP是该策略的关键成分之一。阻断蜱IgG分泌系统的功能和目标关键成分的分泌能快速杀死蜱,因而,利用IGBP研制联合抗蜱疫苗的策略具有现实的可能性。
- 刘光远才学鹏
- 关键词：唾液腺疫苗
- 表达Asia 1型口蹄疫病毒P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株的构建被引量：4
- 2009年
- 为构建表达Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)P1-2A和3C基因的重组山羊痘病毒(GTPV)弱毒株,将Asia 1型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因、蛋白酶3C基因、绿色荧光蛋白(EGFP)基因、痘苗病毒启动子(p7.5)相连,构建成一整体基因表达盒p7.5-EGFP-P12A3C。以GTPV胸苷激酶基因序列中的KpnⅠ酶切位点为插入位点,将整体基因表达盒插入转移载体骨架pUC119-TK中,构建GTPV转移载体pTK-p7.5-EGFP-P12A3C。将转移载体转染GTPV弱毒株AV 41感染的BHK-21细胞,转染后24 h就可见到绿色荧光,表明,成功获得了能表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK-/EGFP+/FMDV P1-2A3C+/GTPV。
- 张强鞠厚斌吴国华颜新敏李健朱海霞马维民郑海学朱彩珠才学鹏
- 关键词：口蹄疫病毒山羊痘病毒胸苷激酶基因
- 长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库的免疫筛选与初步分析被引量：9
- 2008年
- 蜱的免疫预防是目前国内外研究的热点,以抗血清为探针筛选cDNA表达文库是获取功能抗原基因的有效的方法之一,为了获得抗长角血蜱免疫原基因,用兔抗长角血蜱血清和兔抗长角血蜱唾液腺蛋白血清对长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库进行了免疫筛选,经过两轮筛选共获得34个阳性克隆,所得阳性噬菌体转染宿主菌BM25.8使之亚克隆为重组质粒,用此质粒转化宿主菌JM109并进行序列测定和生物信息学分析.结果表明:在长角血蜱雌蜱唾液腺cDNA表达文库中获得26个长角血蜱免疫相关cDNA序列,其编码蛋白与长角血蜱HL35、黏附素hlim3假定蛋白、热休克蛋白、NADH脱氢酶、钙网蛋白以及杂色花蜱和肩突硬蜱的二硫异构酶等具有同源性.所获阳性克隆为长角血蜱保护性抗原基因的筛选奠定了基础.
- 刘光远谢俊仁田占成李知新龚真莉王路柴慧萍才学鹏
- 关键词：长角血蜱唾液腺CDNA表达文库免疫筛选
