北京市自然科学基金(7042008)
- 作品数：3 被引量：12H指数：2
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- 相关机构：首都医科大学更多>>
- 发文基金：北京市自然科学基金国家重点基础研究发展计划北京市教育委员会科技发展计划面上项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 骨髓间充质干细胞基因工程改造方法的比较被引量：6
- 2007年
- 目的:对脂质体介导、反转录病毒载体介导、腺相关病毒载体介导这3种常用的基因转染方法进行比较,寻找一种适合于骨髓间充质干细胞的基因转移方法。方法:实验于2004-10/2005-06在首都医科大学北京神经科学研究所完成。①在脂质体介导下,将增强的绿色荧光蛋白基因导入骨髓间充质干细胞,然后通过G418抗性筛选,观察转染效率。②反转录病毒介导的基因转染,首先利用LipofectAMINETM 2000转染包装细胞系PT67,获得重组反转录病毒上清,然后用病毒上清直接感染骨髓间充质干细胞。转染后的细胞同样用G418筛选,得到阳性克隆后进行定点消化、扩增。③在腺相关病毒介导的基因转染过程中,首先通过磷酸钙沉淀法转染包装细胞系HEK293,得到重组AAV-LacZ病毒颗粒直接感染骨髓间充质干细胞,1周后进行β-gal染色,计算转染效率。结果:①脂质体介导的基因转染24h后在荧光显微镜下观察,可见少量细胞呈现绿色荧光蛋白阳性,阳性率大约为5%。抗生素筛选3周后细胞全部死亡,经过多次试验均未得到阳性细胞克隆。②反转录病毒感染后,在荧光显微镜下观察可见少量骨髓间充质干细胞表达增强的绿色荧光蛋白。当加入G418筛选后,大量细胞死亡,1周后仅有极少数细胞存活。继续培养3～4周后,细胞形成克隆,定点消化细胞克隆,扩增后95%的细胞表达绿色荧光蛋白。③腺相关病毒上清感染骨髓基质细胞1周后,用β-gal染色估计骨髓间充质干细胞转染效率大约为75%。但传代后阳性细胞所占比例明显下降,大约2%。结论:骨髓间充质干细胞易于接受外援基因。3种基因转移方法相比:脂质体转染法转染效率最低,不适合骨髓间充质干细胞;反转录病毒载体法感染效率最高,最适用于骨髓间充质干细胞;而腺相关病毒载体法感染效率较高,但该载体系统没有抗生素筛选,所以无法使阳性细胞得到纯�
- 鲁玲玲赵焕英赵春礼孙晓红段春礼杨慧
- 关键词：间质干细胞骨髓细胞转染腺病毒科
- 大鼠骨髓基质细胞在脑内的迁移和分化被引量：4
- 2008年
- 目的研究骨髓基质细胞（bMSCs）在大鼠脑内的迁移和分化情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs，原代培养8～10d后，同时用含增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的反转录病毒上清转导bMSCs并进行抗性筛选，7～10d可得到稳定表达EGFP的bMSCs，然后将EGFP标记的bMSCs通过侧脑室和尾静脉2种注射方式分别注入纹状体损伤的大鼠体内，进而观察bMSCs向脑内迁移和分化的情况。结果在移植后的大鼠脑内均观察到2种方式植入大鼠体内的bMSCs，这些EGFP阳性的细胞呈现出一些神经元和神经胶质细胞的形态并能表达一些神经元和神经胶质细胞的特异性标志物。结论骨髓基质细胞中确实含有能够向神经元方向分化的干细胞。
- 段春礼姬曼孙晓红赵春礼杨慧
- 关键词：绿色荧光蛋白骨髓间充质干细胞迁移分化
- 绿色荧光蛋白和酪氨酸羟化酶在骨髓基质细胞中的表达被引量：2
- 2006年
- 目的研究反转录病毒介导的绿色荧光蛋白（EGFP）基因和酪氨酸羟化酶（TH）基因在原代培养的骨髓基质细胞（bMSCs）中的表达情况。方法体外分离培养大鼠四肢骨的bMSCs，原代培养8～10d后，同时利用含EGFP和TH基因的反转录病毒上清依次转染bMSCs并进行抗性筛选，7～10d可得到稳定表达EGFP的bMSCs，在稳定转染EGFP后10d进行TH病毒上清的转染，7—10d可得到稳定表达TH和EGFP的bMSCs。结果原代培养bMSCs3—4d后生长至70％一80％汇合，病毒转染EGFP后第2天，细胞呈现弱荧光，经G418筛选2—3d后出现阳性细胞，约8～10d生长融合，阳性率60％～70％，第2—5代阳性细胞比率无明显变化。TH阳性率也达60％以上。结论利用反转录病毒载体可有效地将EGFP和TH基因转至bMSCs中，并能在体外稳定表达传代。这种表达EGFP和TH的bMSCs对于研究bMSCs的体内迁移分化及帕金森病（PD）的基因治疗具有重要意义。
- 赵春礼段春礼张海燕孙晓红赵焕英鲁强刘玉军杨慧
- 关键词：绿色荧光蛋白酪氨酸羟化酶骨髓基质细胞反转录病毒载体
