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双链RNA和植物对病毒的抗性被引量：1: 2006年; 双链RNA能诱导转录后的基因沉默,是生物抵御病毒入侵、维持自身基因稳定的一种自我保护机制.把源自病毒的基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的高抗性.RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在风险,具有较高的生物安全性.双链RNA抗病毒转基因正在成为一种高效、安全的植物抗病毒策略.; 白云凤王小琦白冬梅郭志华张维锋; 关键词：双链RNA 基因沉默抗病毒基因工程

马铃薯总RNA提取和鉴定方法的改进被引量：22: 2007年; 对植物总RNA的提取和鉴定方法作了改进。以马铃薯叶片和茎为材料,分别用常规苯酚法和改进法提取总RNA,通过甲醛变性胶和非变性胶及紫外光谱分析,表明用改进法提取的总RNA与常规苯酚法无明显差异,RNA完整性良好,可以用普通琼脂糖凝胶代替甲醛变性胶电泳分析RNA的完整性。RT-PCR结果表明,以改进法提取的总RNA可以用于分子克隆和基因表达分析等分子生物学实验。利用改进法提取植物总RNA,能降低成本,节约时间,也避免了使用DEPC和甲醛等试剂。; 白云凤郭志华白冬梅王小琦张维锋; 关键词：马铃薯总RNA提取

一种马铃薯高效无标记转基因技术的建立被引量：7: 2007年; 用农杆菌介导法转化马铃薯栽培品种紫花白的叶盘,通过1/4 MS培养基预培养、热激处理、低pH、高糖培养基共培养,之后利用PCR直接检测转化体,结果表明遗传转化效率可达5.1%,建立了马铃薯无标记转基因技术.该技术受基因型的限制小,用于其它3个不同的栽培品种东北白、晋薯7号和早大白,遗传转化效率亦达到了4.1%－8.3%.利用这项无标记转基因技术,在载体构建时就剔除了标记基因,遗传转化后直接分化培养,不必对转化细胞进行抗性筛选,缩短了遗传转化周期,省去了费时费力的标记基因剔除步骤,亦为重复转化聚合多个优良基因提供了便利.; 白云凤张维锋白冬梅王国英王茅雁; 关键词：马铃薯根癌农杆菌无标记

马铃薯X病毒山西分离物外壳蛋白基因的克隆和核苷酸序列分析被引量：1: 2008年; 对GenBank公布的马铃薯X病毒的基因组核苷酸序列和外壳蛋白基因的核苷酸序列进行了同源性比对分析．结果表明，马铃薯X病毒外壳蛋白基凶核苷酸序列的同源性要高于基因组全序列的同源性，并且外壳蛋白基因3端核苷酸序列的同源性又高于5＇端．设计一对特异性引物，以马铃薯感病植株的总RNA为模板，经RT-PCR扩增得到了马铃薯X病毒外壳蛋白基因．该基因含714个核苷酸，编码238个氨基酸．核苷酸序列比对结果表明，该基因与Genbank公布的马铃薯X病毒其他分离物的外壳蛋白基因的同源性为80．2％～97．5％，且3’端的同源性要高于5’端．上述结果预示，RNA干扰抗病毒基因工程中，利用马铃薯X病毒外壳蛋白基因的3’端比用5’端是更好的策略．; 白云凤白冬梅张维锋田芙蓉; 关键词：马铃薯X病毒外壳蛋白基因克隆核苷酸序列分析

双链RNA激发的植物基因沉默及其在植物育种上的应用被引量：2: 2008年; 在生物体内,存在大量的非编码RNA(ncRNA),小干扰RNA(siRNA)是其中一种,由双链RNA切割形成,能干扰基因表达,激发转录后的基因沉默。尽管双链RNA干扰是把基因"敲低"而不是"敲除",但它的高效和易操作性使之成为研究植物基因功能的有用工具,并通过转基因途径用于植物改良。与反义RNA技术和共抑制技术相比,RNA干扰对基因的沉默效率高,效果稳定。单基因RNA干扰就可调控多基因家族控制的农艺性状,而不必累积单基因突变。把病毒基因构建成反向重复结构转入植物体内,其转录出的RNA会通过分子内序列互补形成双链结构,激发转基因植物的RNA干扰机制,将入侵病毒的同源序列降解,使转基因植株获得对病毒的抗性。RNA干扰型抗病毒转基因植株中,转病毒基因的mRNA不存在或存在量很少,也不会翻译成有功能的病毒蛋白质,因此不存在病毒RNA重组、异源包装及协生作用的潜在生物风险,具有较高的生物安全性。; 白云凤王小琦郭志华张维锋; 关键词：双链RNA 基因沉默抗病毒基因工程

马铃薯卷叶病毒(PLRV)内蒙古分离物基因间隔区(IS)的克隆与序列分析被引量：7: 2007年; 根据Genbank已报道马铃薯卷叶病毒(PLRV)基因组序列,分析其基因间隔区(IS)两端的保守区,自行设计、合成一对特异性引物,以PLRV内蒙古分离物总RNA为模板,经RT-PCR扩增得到含PLRVIS的一段369 bp的cDNA,克隆于载体pBS-T中。重组质粒经PCR鉴定、酶切分析和核苷酸序列测定,并进一步与PLRV其他分离物的同源序列作比对。结果表明:克隆的PLRV内蒙古分离物的IS序列与其他全部已发表的13个全基因组中的IS核苷酸序列有很高的同源性,最高达到100%,平均为97.90%,高于这13个PLRV全基因组序列96.81%的同源性,说明IS序列不仅在PLRV的不同株系间比较保守,而且在PLRV的全基因组序列中也是相对保守的。研究结果预示,将IS构建成RNA干扰型结构导入马铃薯,将有可能获得抗PLRV多种株系且抗性更高的转基因植株。; 郭志华孙毅张效梅张健白云凤; 关键词：CDNA克隆

抗双病毒无标记转基因马铃薯的获得被引量：3: 2008年; 病毒侵染导致品种退化是马铃薯生产中的一大难题.利用RNA沉默技术和无标记转基因技术,把马铃薯X病毒的外壳蛋白基因(cp)片段和马铃薯Y病毒的复制酶基因(NIb)片段的融合基因构建成反向重复序列,农杆菌介导转入马铃薯品种紫花白,经PCR检测初筛的转基因植株定植.对定植当代和薯块繁殖的无性一代植株接种马铃薯X病毒和Y病毒,利用半定量RT-PCR和DAS-ELISA检测,鉴定出了对马铃薯X病毒与Y病毒双抗的无标记转基因株系.siRNA的Northern blot结果表明,所转基因的mRNA已经降解成小片段,转基因植株的双抗性是RNA沉默的结果.由于转基因的mRNA已降解,转基因植株不存在标记基因,同时规避了目的基因和标记基因的潜在生物风险.; 白云凤郭志华王小琦白冬梅张维锋; 关键词：马铃薯无标记 RNA沉默多抗转基因

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国家自然科学基金(30471102)