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浙江省自然科学基金(Y206009)

作品数:3 被引量:1H指数:1
相关作者:宁铂涛沈红强钱柏芹曹江汤永民更多>>
相关机构:浙江大学医学院附属儿童医院浙江大学医学院附属邵逸夫医院浙江大学更多>>
发文基金:浙江省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
相关领域:医药卫生更多>>

文献类型

  • 3篇中文期刊文章

领域

  • 3篇医药卫生

主题

  • 3篇克隆
  • 3篇CD14
  • 2篇单链
  • 2篇单链抗体
  • 2篇抗体
  • 1篇单抗
  • 1篇单克隆
  • 1篇遗传学
  • 1篇原核
  • 1篇原核表达
  • 1篇原核表达载体
  • 1篇原核细胞
  • 1篇真核
  • 1篇真核表达
  • 1篇重链
  • 1篇重链可变区
  • 1篇重链可变区基...
  • 1篇细胞
  • 1篇流式细胞
  • 1篇流式细胞术

机构

  • 3篇浙江大学医学...
  • 1篇浙江大学
  • 1篇浙江大学医学...

作者

  • 3篇汤永民
  • 3篇曹江
  • 3篇钱柏芹
  • 3篇沈红强
  • 3篇宁铂涛

传媒

  • 2篇浙江大学学报...
  • 1篇中华儿科杂志

年份

  • 2篇2008
  • 1篇2007
3 条 记 录,以下是 1-3
排序方式:
鼠抗人CD14单链抗体ScFv2F9原核表达载体的构建和表达
2008年
目的:构建ZCH-7-2F9(简称2F9)单链抗体(ScFv2F9)原核表达载体,获得活性目的蛋白,为2F9免疫毒素及其它类型的基因工程抗体的研究奠定基础。方法:根据VH2F9、VL2F9、(G4S)3基因序列以及pIVEX2.3-MCS空载体多克隆位点内切酶位点NdeI和SmaI的核酸序列设计引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拚接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增克隆到ScFv2F9基因,T-A克隆、测序核实后克隆到pIVEX2.3-MCS空载体中,阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株E.coli BL21star(DE3)plysS,IPTG诱导目的蛋白表达,镍树脂纯化后体外复性浓缩,流式细胞术观察其识别和结合CD14的能力。结果:成功构建ScFv2F9的原核表达载体pIVEX2.3-MCS/ScFv2F9;对大肠杆菌的包涵体进行纯化复性,其复性率为32.6%;通过流式细胞术观察到复性ScFv2F9对亲本单抗2F9-FITC有部分的阻滞效果,复性ScFv2F9阻滞1次后阳性细胞百分数、平均荧光强度(MFI)和高峰频道(peakCh)分别下降了11.73%、11.96%和31.57%,阻滞2次后分别下降了26.44%、21.75%和42.11%。结论:ScFv2F9在原核细胞中获得成功表达,复性后目的蛋白对人CD14有一定的识别和结合能力,为2F9单抗的进一步改造打下了坚实的基础。
宁铂涛汤永民曹江沈红强钱柏芹
关键词:原核细胞抗体单克隆流式细胞术
抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析被引量:1
2007年
目的:获取抗人CD14单克隆抗体(单抗)ZCH-7-2F9(简称2F9)轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因,为2F9单链抗体(ScFv2F9)的构建奠定基础。方法:复苏2F9和NS-1细胞株,并亚克隆2F9细胞株,从其最佳克隆93A10提取总RNA,RQ1 RNase-Free DNase处理污染的DNA,与NS-1细胞进行同步对照,通过RT-PCR,扩增获得2F9单抗VL基因和VH基因,分别克隆入pGEM○R-T Easy载体,然后转化DH5α细菌,酶切鉴定并纯化阳性重组子,测序后进行在线核苷酸序列分析。结果:2F9单抗VL基因全长321 bp,编码107个氨基酸,归属于小鼠Ig的Vκ基因,氨基酸序列分析结果显示,VL含有明确的4个框架区(FR)和3个抗原决定簇互补区(CDR),在第23位和第88位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸;其VH基因全长360 bp,编码120个氨基酸,归属于小鼠Ig的VH基因,氨基酸序列分析结果显示,VH含有明确的4个框架区和3个抗原决定簇互补区,在第22位和第96位为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两种特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别是2F9单抗的VL和VH基因,为2F9基因工程抗体研究奠定了坚实的基础。
宁铂涛汤永民曹江沈红强钱柏芹
关键词:基因
抗人CD14新克隆ZCH-7-2F9单链抗体的真核表达和初步鉴定
2008年
目的在真核细胞中表达Zhejiang Children’s Hospital(ZCH)-7-2F9(简称2F9)单链抗体(scFv2F9)以获得高活性的目的蛋白,为2F9其他类型的基因工程抗体及其免疫毒素的研究奠定基础。方法根据pSectag2A多克隆位点、(G4S)3及scFv2F9基因序列,设计含有SfiI、EcoRI酶切位点、6×His以及终止密码TGA的引物,采用高保真的Taq酶,通过重叠延伸拼接法(splicing by overlap extension,SOE)扩增克隆到scFv2F9基因,将扩增到的目的基因片段克隆到pGEM T—easy载体,测序核实后再克隆到pSectag2A真核分泌型表达载体中。阳性重组质粒pSectag2A/scFv2F9转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞进行目的蛋白的瞬时表达,将培养上清浓缩后,流式细胞术观察其对亲本单抗的阻滞效果。结果真核分泌型表达载体pSectag2A/scFv2F9在CHO细胞中获得成功表达,其相对分子质量为31000。亲本直标单抗2F9-FITC被真核细胞表达的scFv2F9阻滞后其阳性细胞百分数、平均荧光强度和最高峰值分别下降了90.02%、63.30%和63.38%。结论克隆到的2F9V。和2F9VL基因及构建的真核分泌型表达载体pSectag2A/scFv2F9是正确的,scFv2F9在CHO细胞中获得成功的表达,且有较高的识别和结合人CD14抗原的功能。
宁铂涛汤永民曹江沈红强钱柏芹
关键词:单链抗体CD14真核
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