国家自然科学基金(30070353)
- 作品数：7 被引量：19H指数：3
- 相关作者：李华杨葳董婉维王太一王禄增更多>>
- 相关机构：中国医科大学中国医科大学附属第一医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- G418和潮霉素B双重抗性小鼠胚胎干细胞饲养层的制备被引量：4
- 2005年
- 通过脂质体转染的方法,先后将含有neo基因的质粒pWL/neo和含有潮霉素基因的质粒导入NIH3T3细胞中,利用G418和潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,经500μg/ml的G418和300μg/ml潮霉素B压力筛选后,获得了具有G418和潮霉素B双重抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,用PCR法特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段。生长在双抗NIH3T3细胞饲养层上ES细胞基本保持正常ES细胞特征,成功地培育了G418和潮霉素双重抗性的NIH3T3细胞,为进行pTet-on和pTRE-H-Insulin目的基因电转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。
- 张梅英李华董婉维秦英杨葳王禄增王太一
- 关键词：胚胎干细胞饲养层细胞NIH3T3细胞G418脂质体转染
- 血清抵抗素水平与2型糖尿病周围神经病变相关关系的研究被引量：4
- 2005年
- 目的研究血清抵抗素与2型糖尿病合并周围神经病变的相关关系及影响因素。方法按腓神经传导速度(SCV)将2型糖尿病患者分为伴有或不伴有周围神经病变组,对照组为健康体检人群。3组研究对象均采用ELISA法测定血清抵抗素水平,同时测定血糖、血脂、血清胰岛素、糖化血红蛋白(HbA1c)等生化指标,并计算胰岛素敏感指数(HOMA-IR),作为评价胰岛素抵抗程度的指标。结果2型糖尿病患者血清抵抗素水平明显高于对照组,合并周围神经病变组高于无周围神经病变组;血清抵抗素水平与HOMA-IR、HbA1c、胰岛素、甘油三酯水平呈正相关,与血糖及其他脂代谢指标无明显相关性。结论血清抵抗素与2型糖尿病周围神经病变相关,参与周围神经病变形成的因素可能也影响了血清抵抗素的水平,同时抵抗素也影响着周围神经病变的发生和发展。
- 赵晓娟于学满赵玉岩
- 关键词：抵抗素糖尿病周围神经胰岛素抵抗
- 具G418抗性NIH3T3细胞饲养层的制备(英文)
- 2006年
- 背景:建立具有抗药(新霉素或潮霉素)性的饲养层细胞是转染外源目的基因胚胎干细胞阳性克隆的筛选必备条件。建成的具有抗药性的NIH3T3细胞系可用于胚胎干细胞其他目的基因的筛选。目的:建立具有G418抗性的NIH3T3细胞系,用于转染pTet-on基因的胚胎干细胞阳性细胞克隆筛选的饲养层。设计:细胞培养观察及DNA检测。单位:中国医科大学实验动物部。材料:NIH3T3细胞由中国医科大学细胞生物教研室惠赠,pWL/neo质粒为美国哈佛大学医学院金壮教授惠赠。G418、白血病抑制因子(胚胎干细胞GRO106U/mL)、DMEM为GIBCOBRL产品,丝裂霉素-C、DIG标记及检测试剂盒为Roche产品,脂质体为Invitrogen产品,均购自沈阳联星生物技术有限公司。方法:①通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入NIH3T3细胞中。②将细胞传至25mL培养瓶中,加入梯度浓度的G418继续培养,通过观察细胞生长及死亡情况测定G418对NIH3T3细胞最小致死量。③将转染的细胞进行传代,挑取单个细胞的克隆至24孔培养板继续进行筛选扩增,选用正常的NIH3T3细胞加入相同剂量的G418的选择性培养基作为筛选的阴性对照。④采用较低的细胞密度铺板,加入含最小致死量G418的DMEM培养基进行再次筛选;同时选用正常的NIH3T3细胞为对照,使用含有最小致死量G418及未加G418的DMEM培养基进行培养,采用光学显微镜对G418抗性NIH3T3细胞进行观察。⑤选用具有G418抗性的NIH3T3细胞和小鼠胚胎成纤维细胞分别作为饲养层细胞进行传代,采用光学显微镜对培养后胚胎干细胞-D3细胞进行观察,并制备细胞DNA,对其进行PCR和southernblot鉴定。主要观察指标:①G418对NIH3T3细胞最小致死量的测定结果。②G418抗性NIH3T3细胞的筛选结果。③G418抗性NIH3T3细胞的生长观察结果。④胚胎干细胞-D3细胞生长观察结果及G418抗性NIH3T3细胞的鉴定。结果:①G418对NIH3
- 张梅英李华董婉维杨葳汪瑛秦英王禄增王太一
- 关键词：转染饲养层胚胎干细胞抗药性
- 抗G418小鼠胚胎干细胞饲养层的制备被引量：8
- 2005年
- 目的:建立具有G418抗性的 3T3细胞系,用于转染pTet on基因的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法: 通过脂质体转染的方法,将含有neo基因的质粒pWL/neo导入 3T3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR鉴定。结果:经 500μg/ml的G418压力筛选后,获得了抗G418细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异,用特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出对应的核苷酸片段,Southernblot鉴定结果表明neo基因片段已整合入G418抗性 3T3细胞中。结论:成功地培育了G418抗性的 3T3细胞,为进行pTet on基因转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。
- 张梅英李华董婉维杨葳汪瑛秦英王禄增王太一
- 关键词：3T3细胞饲养层胚胎干细胞
- 稳定整合pTet-on载体小鼠胚胎干细胞株的建立被引量：2
- 2006年
- 目的建立稳定整合Tet-on基因的ES-D3细胞系,用于人胰岛素基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中诱导表达调控的研究。方法通过电穿孔转染的方法,将pTet-on质粒导入ES-D3细胞中,利用G418的药物选择特性,对转染的ES-D3细胞进行压力筛选,用PCR和Southern blot方法进行DNA整合鉴定,并用瞬时转染荧光素酶报告基因(pTRE-Luc)对筛选的Tet-on阳性克隆株的功能进行鉴定。结果经400μg/mL的G418压力筛选后,获得了11个细胞克隆株,特异性核苷酸引物检测细胞基因组DNA,有9个ES-D3细胞株可以扩增出相应的核苷酸片段,部分Tet-on阳性ES-D3株Southern blot鉴定结果表明Tet-on基因片段已整合入ES-D3细胞基因组DNA,荧光素酶报告基因功能鉴定获得1株诱导表达倍率为21.31的ES-D3细胞株,且Tet-on基因阳性ES-D3细胞的形态和生长速度与正常ES-D3细胞没有差异。结论通过电穿孔转染的方法成功地获得1株诱导表达倍率为21.31的高表达ES-D3细胞株,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)在ES-D3细胞中转染和诱导表达打下了基础。
- 张梅英李华董婉维杨葳秦英汪瑛周生来于洋王惟王太一王禄增
- 关键词：电穿孔细胞
- 潮霉素抗性3T3细胞的建立和鉴定被引量：1
- 2004年
- 目的 建立具有潮霉素 (hygromycin)抗性的 3T3细胞系 ,用于转染目的基因 (pTRE Ins human)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法 通过脂质体转染的方法 ,将含有潮霉素B磷酸转移酶基因的质粒pHyg导入 3T3细胞中 ,利用潮霉素的药物选择特性 ,对转染细胞进行压力筛选 ,并对其进行PCR鉴定。结果 经 5 0 0 μg ml的潮霉素压力筛选后 ,获得了抗性细胞克隆。抗性 3T3细胞的形态和生长速度与正常 3T3细胞没有差异 ,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA ,可以扩增出对应的核苷酸片段。结论 成功地培育了潮霉素抗性的 3T3细胞 ,为进行目的基因 (pTRE Ins human)转染ES细胞的阳性细胞克隆筛选奠定了基础。
- 张梅英李华董婉维杨葳王禄增王太一
- 关键词：潮霉素抗性细胞饲养层
- 具有潮霉素B抗性的NIH3T3细胞饲养层的制备被引量：2
- 2005年
- 目的建立具有潮霉素B(hygromycin B)抗性的3T3细胞系,用于转染目的基因(pTRE2 -human-Ins)的ES阳性细胞克隆筛选的饲养层。方法通过脂质体转染的方法,将含有潮霉素B 磷酸转移酶基因(hyg)的质粒pHyg导入NIH3T3细胞中,利用潮霉素B的药物选择特性,对转染细胞进行压力筛选,并对其进行PCR和Southern blot鉴定。结果经300 μg／ml的潮霉素B压力筛选后,获得了抗性细胞克隆。抗性NIH3T3细胞的形态和生长速度与正常NIH3T3细胞没有差异,特异性核苷酸引物检测抗性细胞基因组DNA,可以扩增出相应的核苷酸片段,Southern blot 鉴定结果表明潮霉素基因片段已整合入潮霉素抗性NIH3T3细胞。结论本实验通过脂质体介导的方法成功地培育了潮霉素B抗性的NIH3T3细胞,为进行目的基因(pTRE2-human-Ins)转染ES 细胞的阳性细胞克隆筛选打下了基础。
- 张梅英李华董婉维杨葳秦英汪瑛周生来于洋王惟王太一王禄增
- 关键词：NIH3T3细胞转染ES细胞
