“九五”国家科技攻关计划(98D063)
- 作品数：17 被引量：62H指数：5
- 相关作者：成军刘妍王建军纪冬张玲霞更多>>
- 相关机构：解放军第302医院北京地坛医院西安交通大学医学院第一附属医院更多>>
- 发文基金：“九五”国家科技攻关计划国家自然科学基金Scientific Research Foundation for the Returned Overseas Chinese Scholars, State Education Ministry更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 人类HBxAg蛋白反式激活基因5的原核表达及其蛋白纯化被引量：1
- 2007年
- 为了更深入研究XTP5蛋白(也称人类次要组织相容性抗原(mHA-8))的生物学功能,以HepG2细胞总RNA为模板、应用RT-PCR技术获得XTP5基因,再利用基因工程技术对其进行克隆和原核重组表达载体构建和诱导表达,成功克隆XTP5基因,并成功构建原核重组表达空载体pET-32a(+)-XTP5;阳性重组质粒转化大肠杆菌E.coliBL21后,在37℃经终浓度1 mmoL/L IPTG诱导5 h后,受体菌大量表达76.88 ku XTP5重组蛋白;West-ern-blot证实宿主菌表达的蛋白特异性好;肝素亲和层析柱纯化表达产物XTP5蛋白效果良好。结果表明,成功克隆了人类XTP5基因,并获得纯度较高的融合蛋白XTP5。
- 蓝贤勇成军陈宏张黎颖陶明亮伦永志洪源郭江
- 应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因被引量：5
- 2004年
- 目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术构建膦甲酸钠 (PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库 ,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因 ,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞 ,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照 ;2 4h后制备细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行 2次消减杂交及 2次抑制性多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到 4 6个阳性克隆 ,进行菌落PCR分析 ,均得到 2 0 0～ 1 0 0 0bp插入片段。挑取含有插入片段的 1 4个克隆进行测序 ,并通过生物信息学分析获得 1 1种已知基因序列和 3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库 。
- 刘妍成军陆荫英王刚王建军张喜全王祥建
- 关键词：膦甲酸钠免疫调节抑制性消减杂交基因克隆
- 基因表达谱芯片技术筛选HBV DNA多聚酶RNase H反式调节基因被引量：3
- 2005年
- 目的:应用基因表达谱芯片(基因芯片)技术,检测乙型肝炎病毒DNA聚合酶RNaseH结构域蛋白(HBVDNAP RNaseH ,RNaseH)的表达对肝母细胞瘤细胞HepG2基因表达谱的影响,进一步阐明RNaseH对肝细胞基因表达的调节机制及其生物学功能。方法:以常规的分子生物学技术构建真核表达载体pcDNA 3 1(-) RNaseH ,以脂质体转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取mRNA ,逆转录为cDNA ,与转染空白表达载体pcDNA 3 1(-)的HepG2细胞进行cDNA芯片分析。结果:RNaseH表达质粒转染的细胞有2 2 2条差异表达基因,其中113条基因表达水平上调,10 9条基因表达水平下调。结论:应用基因芯片成功筛选了RNaseH转染细胞后差异表达基因,为进一步阐明RNaseH的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据。
- 陈国凤王琳成军张健刘妍刘敏张玲霞李莉
- 关键词：基因表达谱芯片技术DNA多聚酶反式调节基因反式激活作用
- HBV X蛋白反式调节基因XTP11的克隆化研究被引量：5
- 2005年
- 目的:应用寡核苷酸基因芯片技术及生物信息学分析,筛选并克隆乙肝病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法:以HBxAg表达质粒pcDNA 3 1(-) X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA 3. 1(-)为平行对照,提取mRNA并进行寡核苷酸基因芯片分析。对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索和比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA 3 . 1(-) X的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)技术,扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实。结果:该新基因命名为XTP11,在GenBank中注册,注册号为AY740 5 2 0。该基因的编码序列全长为13 44个核苷酸(nt) ,编码产物由44 8个氨基酸残基(aa)组成。结论:HBxAg反式激活新型靶基因XTP11的筛选与克隆,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制奠定基础。
- 李进刘妍成军纪冬宫曼张玲霞陈菊梅
- 关键词：反式调节基因克隆化研究HBXAG乙肝病毒X蛋白反式激活作用
- 酵母双杂交技术筛选乙型肝炎e抗原反式激活蛋白结合蛋白的基因被引量：5
- 2005年
- 目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与乙型肝炎e抗原反式激活蛋白(HBeAgTP)相互作用蛋白的基因。方法应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆HBeAg反式激活的新型靶基因HBeAgTP。用聚合酶链反应(PCR)法扩增HBeAgTP基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析。结果成功克隆出HBeAgTP基因并在酵母细胞中表达,应用酵母双杂交筛选出阳性菌落24个,经生物信息学分析为15种已知基因。结论成功克隆出HBeAgTP的结合蛋白,包括一些与细胞内蛋白质的转录、翻译、免疫调节及物质和能量代谢相关的基因。
- 王建军成军刘敏杨倩蔺淑梅刘妍
- 关键词：酵母双杂交技术乙型肝炎E抗原基因
- 丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究被引量：3
- 2004年
- 目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。
- 刘妍杨倩成军王建军纪冬王春花党晓燕张玲霞
- 关键词：丙型非结构蛋白NS5A反式激活基因克隆化
- 乙型肝炎病毒前S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1基因表达的上调作用研究被引量：2
- 2004年
- 目的 探讨乙型肝炎病毒 (HBV)前 S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶 1(TXNRD1)启动子转录的激活作用。方法 以 30 2院传染病研究所基因治疗研究中心自行构建的乙型肝炎病毒前 S2蛋白反式调节的基因表达谱芯片结果为基础 ,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域 (TXNRD1p) ,PCR扩增TXNRD1p ,克隆至真核报告载体pCAT3 Basic中 ,构建 pCAT3 TXNRD1p报告载体 ;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系 ,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性 ;并与pcDNA3 1(- ) preS2共转染HepG2细胞系 ,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果 pCAT3 TXNRD1p和pcDNA3 1(- ) preS2瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3 Basic空载体的 5 7倍、pCAT3 TXNRD1p的 2 2倍。结论 该TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性 ;HBV的前 S2蛋白具有反式激活TXNRD1的作用。
- 纪冬成军郭江杨瑗董菁王建军刘妍
- 关键词：病毒性肝炎乙型启动子反式激活
- 噬菌体表面展示技术的新发展及在病毒性肝炎研究中的应用被引量：1
- 2004年
- 噬菌体展示技术是一种目的基因在噬菌体表面的表达产物与亲和选择相结合的技术。噬菌体结构蛋白pⅢ和pⅧ均可作为载体来展示外源多肽或蛋白质。初期阶段 ,噬菌体展示技术主要是用于单链可变区抗体、随机多肽库等的筛选 ,但近年来随着噬菌体cDNA表达型文库的构建 ,噬菌体展示技术的用途逐渐扩大。目前噬菌体展示技术不仅可以用于研究蛋白结合蛋白 ,而且还可以用来研究DNA/RNA结合蛋白 ,以及非蛋白小分子物质的结合蛋白等。因为蛋白 蛋白之间的结合是许多生物学效应的基础 ,因而噬菌体展示技术的应用范围进一步得到拓展。噬菌体展示技术在研究自身抗体结合与识别的自身抗原、信号转导过程中蛋白之间的相互作用以及肝炎病毒基因表达调节方面都有十分重要的应用前景。
- 成军
- 关键词：噬菌体噬菌体展示技术肝炎病毒基因文库
- 乙型肝炎病毒基因异质性及准种特点研究的临床意义被引量：25
- 2002年
- 乙型肝炎病毒 (HBV)基因组在慢性HBV感染的个体中存在不同的基因型 (genotype)、血清型 (serotype)和准种 (quasispecies)等基因序列异质性 (heterogeneity)的特点。HBV基因序列异质性是普遍存在的 ,在HBV基因组的各结构基因区、调节基因区都有异质性的特点 ,而且始终处在持续变化之中。HBV基因序列的异质性具有十分重要的生物医学意义。HBV准种等异质性特点的研究 ,使我们对于HBV全基因序列、HBV基因突变的规律、HBV抗药性的遗传学基础 ,甚至导致肝细胞恶性转化的分子生物学机制等都有了全新的认识。准种概念的引入 ,使我们对于HBV基因序列异质性的认识 ,从单一病毒株水平提升到HBV种群的水平 ,是对于HBV基因遗传与变异认识的一次革命性的飞跃。
- 成军
- 关键词：乙型肝炎病毒血清分型准种反式激活HBV
- NS5A-TP5蛋白结合蛋白1的基因克隆化研究
- 2004年
- 目的 :应用酵母双杂交技术及生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆NS5A TP5蛋白结合蛋白基因1(NBP1)。方法 :应用酵母双杂交系统 3 ,构建NS5A TP5诱饵质粒 ,转化酵母AH10 9,与含人肝细胞cDNA文库质粒的酵母Y 187进行配合 ,于涂有x α gal营养缺陷型培养基 (SD/Trp Leu His Ade)上筛选生长。 结果 :挑选蓝色克隆 ,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌提取质粒DNA后进行测序 ,然后进行生物信息学分析 ,新基因的开放读码框架长度为 2 40个核苷酸 (nt) ,编码产物由 79个氨基酸残基 (aa)组成 ,命名为NBP1,GenBank注册号为AY 45 92 91。结论 :NBP1的筛选与克隆 ,可为进一步研究HCVNS5A
- 张健刘妍成军王琳邵清刘敏
- 关键词：NS5A基因克隆化营养缺陷型酵母双杂交系统
