国家自然科学基金(20370635)
- 作品数：7 被引量：11H指数：2
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- 相关机构：中国人民解放军总医院军事医学科学院本元正阳基因技术有限公司更多>>
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- 胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位研究
- 2007年
- 目的研究胃癌相关基因GCRG213在真核细胞的定位。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术,从pGEM-T质粒上选择性扩增出包含完整ORF在内的人胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,将目的片段两端分别引入限制性内切酶PstI和BamHI识别位点,克隆至真核表达载体pEGFP-Nl。将测序正确的阳性重组子pEGFP-Nl-GCRG213采用脂质体瞬时转染COS-7细胞,激光共聚焦技术检测GCRG213基因在真核细胞内的蛋白定位。结果经测序证实,GCRG213正确克隆入真核表达载体pEGFP-Nl,组成阳性重组子pEGFP-Nl-GCRG213。测序正确的pEGFP-N1-GCRG213重组子经脂质体转染COS-7细胞,激光共聚焦显微镜观察GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。结论GCRG213蛋白在胞核和胞质中均有表达。
- 高利利王孟薇吴本俨周涛黄海力尤纬缔王卫华
- 关键词：限制性片段长度转染聚合酶链反应
- 胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞成瘤性的影响被引量：1
- 2007年
- 目的:研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45成瘤性的影响。方法:采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,绘制细胞生长曲线,平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果:平板克隆形成实验显示转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞其细胞克隆形成数量低于转染空载体的细胞。在裸鼠体内进行的转染细胞的成瘤性实验可见,转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性高于转染空载体的细胞,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞在裸鼠体内成瘤性低于转染空载体的细胞。结论:胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞的成瘤性,GCRG213反义转染可抑制肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞的成瘤性。
- 高利利吴本俨王孟薇战大伟黄海力伍银桥尤纬缔王卫华
- 关键词：胃肿瘤胃癌相关基因GCRG213真核表达基因转染
- 胃癌相关基因GCRG 213正反义表达重组腺相关病毒载体的构建被引量：2
- 2007年
- 目的构建胃癌相关基因OCRG 213正、反义表达重组腺相关病毒载体,制备相应的重组腺相关病毒。方法通过引入限制性内切酶识别位点从pGEM-T质粒上扩增出胃癌相关基因GCRG 213的DNA片段,按正、反向克隆入pCMV-MCS载体,测序正确后用NotI酶切,克隆入pAAV-MCS载体,单、双酶切鉴定后,同pAAV-Helper、pAAV- RC质粒用磷酸钙转染法共转染AAV-293细胞制备病毒。结果成功构建包含胃癌相关基因GCRG213正、反义克隆的重组腺相关病毒载体,并制备出滴度为4×1010v．g．／ml腺相关病毒。结论载体的构建和病毒制备为进一步研究GCRG 213的体内功能打下了基础。
- 徐世平吴本俨王孟薇高利利伍银桥蒋立新王卫华尤纬缔
- 关键词：基因转染
- 胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响被引量：5
- 2006年
- 目的研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45生长特性的影响。方法将从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3·1(+)。测序正确的重组子pcDNA3·1-a(含GCRG213正向克隆)、pcDNA3·1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,采用半定量RT-PCR及Westernblot方法比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞,采用细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪分析细胞的增殖状态,AnnexinVFITC/PI双标记法检测凋亡细胞。结果经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3·1(+)。与对应的空载体比较,转染pcD-NA3·1-a的MKN45细胞中mRNA的表达上调35·4%,蛋白的表达上调49·4%,而转染pcDNA3·1-b的MKN45细胞中mRNA的表达下调32·1%,蛋白的表达下调50·3%。转染了GCRG213正向克隆的MKN45细胞生长增殖速度加快,凋亡率下降,而转染了GCRG213反向克隆的MKN45细胞生长增殖速度减慢,凋亡率增加。结论胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞的生长,抑制肿瘤细胞凋亡,可能是恶性肿瘤癌变的促进因素之一。
- 高利利吴本俨王孟薇王珊黄海力伍银桥尤纬缔王卫华
- 关键词：胃肿瘤转染细胞凋亡
- 胃癌相关基因GCRG213真核表达载体的构建及其对胃癌细胞MKN45的影响
- 2008年
- 目的研究胃癌相关基因GCRG213正义、反义转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法采用分子克隆及基因转染技术将GCRG213基因转入哺乳动物细胞,并结合反义转染技术研究GCRG213基因对胃癌细胞恶性生物学行为的影响。结果GCRG213正向和反向克隆正确插入真核表达载体pcDNA3.1(+);重组子pcDNA3.1-a、pcDNA3.1-b和空载体转染人胃癌细胞系MKN45细胞;正义转染其mRNA的表达上调,而反义转染下调;正义转染加快MKN45细胞生长增殖速度、降低细胞凋亡率,反义转染减慢MKN45细胞生长增殖速度,增加细胞凋亡率。结论胃癌相关基因GCRG213可促进肿瘤细胞生长、分裂和转移,抑制肿瘤细胞的凋亡,可能是一个新发现的恶性肿瘤癌变的促进因素。
- 高利利王孟薇吴本俨王珊杨怡黄海力伍银桥尤纬缔王卫华
- 关键词：胃癌相关基因GCRG213真核表达胃癌细胞基因转染
- 胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞生长特性的影响
- 2009年
- 目的研究胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法1)设计两对针对GCRG213可转录为小干扰RNA(siRNA)的DNA片段,退火后插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2)测序正确的重组子IMG-800-1,IMG-800-2和空载体转染MKN45细胞,采用RT-PCR及Western法比较GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。3)绘制细胞生长曲线,分析细胞的增殖状态,检测凋亡细胞。结果1)干扰片段正确插入小干扰RNA表达载体IMG-800。2)重组子和空载体转染MKN45细胞。3)转染siRNA的MKN45细胞中其mRNA的表达下调44.9%和49.5%;其蛋白的表达下调55.3%和64.2%。4)转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度减慢,处于G0-G1期的细胞增加,G2/M期和/或S期的细胞比例减少,细胞凋亡率增加。结论siRNA转染可抑制肿瘤细胞的生长和增殖,促进肿瘤细胞的凋亡。
- 高利利吴本俨王孟薇王珊张林尤纬缔王卫华
- 关键词：RNA干扰细胞凋亡
- 胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA表达载体的构建及其对胃癌细胞的影响被引量：3
- 2007年
- 目的探讨胃癌相关基因GCRG213小干扰RNA（siRNA）转染对胃癌细胞MKN45的影响。方法设计两对针对GCRG213可转录为siRNA的DNA片段，退火后插入siRNA表达载体IMG-800。测序正确的重组子IMG-800-1（含干扰片段1）、IMG-800-2（含干扰片段2）和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞株。采用半定量RT-PCR及Western免疫印迹法，比较转染不同质粒的MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异。选取稳定转染不同质粒的MKN45细胞，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线，流式细胞仪分析细胞的增殖状态，AnnexinV FTTC／PI双标记法检测凋亡细胞，平板克隆形成实验、裸鼠移植瘤实验分析转染细胞成瘤性。结果经测序证实，干扰片段退火后正确插入小干扰RNA表达载体IMG-800，组成重组子IMG-800-1和IMG-800-2。重组子IMG-800-1、IMG-800-2和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞，G418筛选获得稳定转染的细胞株。与对应的空载体比较，RT-PCR结果显示，转染siRNA的MKN45细胞中，mRNA的表达分别下调44．9％和49．5％；Western印迹法结果显示，转染siRNA的MKN45细胞中，蛋白的表达分别下调55．3％和64．2％。与转染空载体的细胞相比，转染siRNA的MKN45细胞生长增殖速度明显减慢，细胞周期表现为处于G0—G1期的细胞有所增加，G2／M期和（或）S期的细胞比例减少，细胞凋亡率增加，细胞克隆形成数量减少，裸鼠体内成瘤性降低。结论胃癌相关基因GCRG213 siRNA转染，可抑制肿瘤细胞的生长和增殖，促进肿瘤细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的成瘤性。
- 高利利吴本俨王孟薇战大伟张林尤纬缔王卫华
- 关键词：胃肿瘤SIRNA转染MKN45
