国家自然科学基金(30170854)
- 作品数：9 被引量：20H指数：2
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- 相关机构：北京军区总医院中国人民解放军白求恩国际和平医院石家庄市第四医院更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 携带外源基因的HBV在HepG2细胞中的表达与复制被引量：2
- 2003年
- 韩聚强胡大荣孙殿兴吴忆贫
- 关键词：外源基因HBVHEPG2乙型肝炎病毒基因复制
- C基因截短型HBV载体的复制、包装与表达被引量：1
- 2004年
- 目的 探索C基因截短型重组HBV载体的复制、包装和表达。方法 采用分子克隆、定点突变技术构建C基因截短型HBV载体 ;瞬时转染HepG2细胞 ,在荧光显微镜下观察外源目的基因绿色荧光蛋白 (GFP)的表达 ;提取转染细胞胞内、胞外DNA分别进行半巢式聚合酶链反应 (PCR)、非变性凝胶电泳杂交技术、southernblot杂交定量分析及常规PCR等分析 ,检测重组HBV载体的复制、包装及子代病毒的生成。结果 经酶切鉴定 ,C基因截短型HBV载体构建成功 ;转染HepG2细胞 ,外源目的基因能够高效表达 ;在辅助载体的辅助下 ,C基因截短型HBV载体能够在肝细胞进行复制 ,包装 ,通过定量分析 ,C基因截短型HBV载体的包装效率比C基因非截短型HBV载体提高 4～ 8倍 ;另外 ,C基因截短型HBV载体可以在辅助载体的辅助下包装成携带外源目的基因的子代病毒颗粒分泌到胞外。结论 C基因部分截短不影响HBV载体外源基因的表达和病毒的复制 ,而且可以提高载体的包装效率。
- 韩聚强胡大荣孙殿兴胡学玲李娟范公忍刘超英吴忆贫
- 关键词：基因表达
- 基因重组HBV联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV作用及HBV包装细胞系的构建被引量：13
- 2002年
- 目的 探讨HBV作为基因治疗载体的可能性并检验其联合表达反义RNA和显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上,经基因修饰后联合表达S区反义RNA和核心-P蛋白的融合蛋白,整合于具有HBV复制的2.2.15细胞,形成细胞克隆,ELISA 法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。HBV全基因经删除包装信号ε区后,插入到G418抗性PCI-neo载体,转染HepG2细胞系,用G418筛选形成细胞克隆,检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系,进一步转染表达复制缺损型HBV的质粒,经两种抗生素同时筛选,PCR方法观察上清液中的病毒。结果 2.2.15-pMEP4组、2.2.15-CP组、2.2.15-SAS组和2.2.15-CPAS组,对HBsAg平均抑制率分别为2.74％±3.83％、40.08％±2.05％（t=35.5,P<0.01）、66.54％±4.45％（t=42.3,P<0.01）和73.68％±5.07％（t=51.9,P<0.01）;对HBeAg平均抑制率分别为4.46％±4.25％、52.86％±1.32％（t=36.2,P<0.01）、26.36％±1.69％（t=22.3,P<0.01）和 59.28％±2.10％（t=39.0,P<0.01）;对 HBV复制的抑制率分别为0、82.0％、59.9％和96.6％。在各治疗组培养上清液中均能检测出重组HBV颗粒。证明包装细胞系具有HBSAg和HBcAg表达。
- 孙殿兴胡大荣邬光惠胡学玲 100700李娟范公忍
- 关键词：基因重组HBV反义RNA基因治疗
- 重组逆转录病毒载体携带乙型肝炎病毒载体的构建与表达被引量：8
- 2002年
- 目的 探索利用逆转录病毒载体表达HBV载体的可能性及复制缺损性HBV能否被正确包装。方法 在逆转录病毒载体中插入表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元 ,制备重组逆转录病毒后分别用以感染HepG2 和 2 2 1 5细胞 ,免疫荧光法检测细胞内HBV核心抗原的表达 ,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 在包装细胞系PA31 7中能形成较高滴度的重组逆转录病毒 ,用以感染HepG2 细胞后 ,可检出核心抗原的表达。感染 2 2 1 5细胞后 ,在培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 重组逆转录病毒能携带HBV载体在细胞内表达 ,并在有野生型HBV提供结构蛋白的前提下 ,发挥HBV载体的功能 。
- 孙殿兴胡大荣邬光惠胡学玲李娟范公忍
- 关键词：逆转录病毒科乙型肝炎病毒基因治疗
- 重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究
- 2007年
- 目的探讨重组逆转录病毒转导HBV载体表达显性阴性突变体的抗HBV作用。方法在逆转录病毒载体中插入两种不同类型表达显性阴性突变体的HBV基因复制单元,制备重组逆转录病毒pRV-CP、pRV-CS和空载体G1Na对照,并转染HepG2.2.15细胞,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBV DNA,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果转染HepG2.2.15细胞后3d、5d、7d、9d和11d,pRV-CP、pRV-CS和G1Na对照组对HBsAg表达的平均抑制率分别为(28.9±4.73)%(P<0.01)、(39.3±7.04)%(P<0.01)和(2.6±3.77)%;对HBeAg表达的平均抑制率分别为(40.38±2.59)%(P<0.01)、(33.1±4.27)%(P<0.01)和(3.1±3.02)%;对HBV复制的抑制率分别为67.2%和55.8%,对照组为13.4%。只有pRV-CP组培养上清液中检测出突变型HBV颗粒。结论重组逆转录病毒能转导HBV载体表达显性阴性突变体,对HBV复制及抗原表达有抑制作用,有望用于抗HBV治疗。
- 孙殿兴刘风军胡大荣胡学玲范公忍韩聚强
- 关键词：逆转录病毒载体基因治疗
- 潮霉素抗性HBV包装细胞系的构建被引量：2
- 2004年
- 目的 配合HBV载体的研究 ,为HBV载体提供包装。方法 HBV全基因经删除包装信号ε区后 ,插入到潮霉素抗性pMEP4载体 ,转染HepG2 细胞系 ,用潮霉素筛选形成细胞克隆。检测表达HBsAg及HBcAg较多者作为HBV包装细胞系 ,进一步转染稳定表达复制缺损型HBV的质粒 ,PCR方法观察上清液中病毒的形成。结果 包装细胞系高表达HBsAg和HBcAg ;携带重组HBV的G4 18抗性重组逆转录病毒感染潮霉素抗性包装细胞系后 ,经两种抗生素同时筛选 ,在细胞培养上清液中能检出突变型HBV ,未检出野生型HBV。结论 删除了包装信号的HBV次全基因 ,失去了形成完整HBV颗粒的能力 ,但能为复制缺损型HBV提供包装所需的结构蛋白。
- 胡大荣孙殿兴熊锦华邬光惠胡学玲李娟范公忍韩聚强
- 关键词：潮霉素HBV细胞系基因疗法抗性基因
- 复制缺损型HBV表达显性阴性突变体抗HBV作用的研究被引量：2
- 2004年
- 目的 探索HBV作为基因治疗载体的可能性及检验HBV点突变表达显性阴性突变体抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达核心 P蛋白及核心 表面抗原的融合蛋白 ,整合于具有HBV复制的 2 2 15细胞 ,形成细胞克隆 ,ELISA法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,PCR检测上清液中重组HBV颗粒。结果 2 2 15 pMEP4组、2 2 15 CP组、2 2 15 CS组 ,对HBsAg平均抑制率分别为 2 74 %±3 83%、4 0 0 8%± 2 0 5 % (P <0 0 1)和 5 2 94 %± 1 93% (P <0 0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为4 4 6 %± 4 2 5 %、5 2 86 %± 1 32 % (P <0 0 1)和 4 1 6 0 %± 1 6 5 % (P <0 0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 15 3%、82 0 %和 6 7 2 %。仅在 2 2 15 CP组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 在细胞内表达显性阴性突变体具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;经修饰后的HBV基因组在野生型HBV辅助下 ,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒。
- 孙殿兴刘风军胡大荣邬光惠胡学玲韩聚强李娟
- 关键词：HBV基因疗法乙型肝炎病毒基因突变
- 改造HBV作为基因治疗载体被引量：1
- 2003年
- HBV具备改造作为肝靶向性基因治疗载体的基本条件———天然嗜肝特异性 ,能够在肝细胞内持续复制、反复感染 ,病毒本身对细胞没有明显的细胞毒性 ;能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒 ;能够介导外源基因的转移和表达。但由于基因结构复杂 ,目前改造的HBV载体均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点。就近年相关研究进展进行综述。
- 韩聚强胡大荣吴忆贫孙殿兴
- 关键词：HBV基因治疗乙型肝炎病毒
- 基因重组HBV的构建及其表达反义RNA抗-HBV作用的研究被引量：1
- 2004年
- 目的 探索利用乙型肝炎病毒 (HBV)作为基因治疗载体的可能性及检验其表达反义RNA抗HBV的作用。方法 在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达S或S启动子区的反义RNA ,整合于具有HBV复制的 2 .2 .15细胞 ,形成细胞克隆 ,酶联免疫吸附 (ELISA)法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,聚合酶链反应(PCR)法检测上清液中重组HBV颗粒。结果 2 .2 .15 pMEP4组、2 .2 .15 SAS组和 2 .2 .15 PAS组对HBsAg平均抑制率分别为 (2 .74± 3.83) %、(6 6 .5 4± 4 .4 5 ) % (P <0 .0 1)和 (5 5 .18± 3.2 7) % (P <0 .0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为 (4 .4 6± 4 .2 5 ) %、(2 6 .36± 1.6 9) % (P <0 .0 1)和 (6 5 .5 4± 3.2 2 ) % (P <0 .0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 17.0 %、5 9.9%和 72 .8%。 2 .2 .15 SAS组及 2 .2 .15 PAS组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论 经过对HBV基因组的两处改造 ,分别在细胞内表达S区及S启动子区反义RNA具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;在 2 .2 .15细胞中野生型HBV辅助下 。
- 孙殿兴刘风军胡大荣邬光惠胡学玲李娟范公忍
- 关键词：反义RNA基因疗法乙型肝炎
