云南省应用基础研究基金(KKSA201126005)
- 作品数：18 被引量：51H指数：4
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- 红冬孢酵母苹果酸酶基因RKME1的克隆与表达
- 2017年
- 苹果酸酶(malic enzyme,ME)普遍存在于各种生物体中,在二价阳离子(Mg^(2+)或者Mn^(2+))的存在下,它可以催化L-苹果酸进行氧化脱羧反应,产生丙酮酸、CO_2和NADPH。前期分析结果预测红冬孢酵母YM25235菌株具有2个苹果酸酶同功酶基因RKME1和RKME2,而且RKME1基因在15℃低温条件下mRNA转录水平显著提高。为了验证RKME1的结构与功能,以红冬孢酵母YM25235 cDNA为模板,PCR扩增得到大小为1 623 bp的开放阅读框,共编码540个氨基酸。序列分析结果显示该序列含有苹果酸酶保守的4个结构域(Ⅰ~Ⅳ),同源建模结果显示该序列的三级结构和蛔虫中的苹果酸酶晶体结构有较高相似性且高度保守。进一步将RKME1插入到载体pET32a(+)中构建重组表达质粒pET32a-RKME1,然后导入大肠杆菌BL21中进行表达。经IPTG诱导,获得了相对分子质量约为70 kD的蛋白质条带。将该蛋白质进行镍柱亲和层析纯化后,酶活分析的结果表明,重组表达的RKME1蛋白可催化苹果酸脱氢生成丙酮酸,同时生成NADPH,酶活为160 U/mg以上。上述结果表明,RKME1是一个新的苹果酸酶基因,这为深入研究苹果酸酶与红冬孢酵母低温条件下生长适应性之间的关系奠定了基础。
- 肖虎熊向峰崔锦锦季秀玲林连兵魏云林张琦
- 关键词：苹果酸酶基因克隆生物信息学酶活
- 多不饱和脂肪酸与红冬孢酵母低温适应性的关系研究被引量：5
- 2014年
- 以一株产油酵母——红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235作为出发菌株,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化和多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA表达水平的关系.结果显示,YM25235在5～35℃温度条件下均能生长,最适生长温度为30℃.低温条件下细胞膜流动性明显降低,但是多不饱和脂肪酸质量分数由从30℃时的24.35%增加到15℃时的40.32%,而且15℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA水平提高了3.4倍.结果说明低温条件下细胞膜流动性下降,导致多不饱和脂肪酸合成相关基因表达水平提高,使得细胞膜脂中多不饱和脂肪酸含量增加,促进了菌株低温生长适应性.
- 何仕武杨昭杰林连兵季秀玲魏云林张琦
- 关键词：多不饱和脂肪酸
- 多不饱和脂肪酸与粘红酵母低温适应性的关系被引量：4
- 2014年
- 以一株粘红酵母(Rhodotorula glutinis)YM25079为研究对象,分析其低温生长适应性与细胞膜流动性、膜脂脂肪酸含量的变化以及多不饱和脂肪酸合成关键基因——Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平的关系.结果显示,YM25079在5-30℃温度条件下均能生长,最适生长温度为15℃.在15℃培养条件下,YM25079细胞膜流动性没有明显降低,但是多不饱和脂肪酸含量显著提高,由25℃时29.4%增加到15℃时的55.39%,而且15℃时Δ12-脂肪酸脱氢酶基因mRNA转录水平提高了5倍.这些研究结果表明,粘红酵母YM25079的低温生长适应性可能是通过提高多不饱和脂肪酸合成相关基因的表达水平,增加膜脂中多不饱和脂肪酸含量,维持低温条件下细胞膜的流动性来形成的.
- 杨昭杰李凌彦胡彬彬林连兵魏云林季秀玲张琦
- 关键词：粘红酵母多不饱和脂肪酸膜流动性
- 促进微生物生产多不饱和脂肪酸的研究被引量：3
- 2015年
- 多不饱和脂肪酸(PUFAs)作为功能性油脂已被广泛应用于食品工业领域。随着对纯PUFAs脂质的需求量越来越多,来自于动植物和深海洋鱼的PUFAs远远不能满足市场需求,且动植物含油量及不饱和脂肪酸类型、比例均受到一定的限制。一系列的研究表明,微生物特别是藻类、真菌能合成几乎所有的PUFAs,并能在工业规模上培育有开发价值的可替代生物资源。作者在近年来国内外有关研究的基础上,从培养条件、菌种选育、基因工程、代谢调控等方面对促进微生物产PUFAs的研究进行了综述,为相关的研究提供参考。
- 张琦李凌彦赵汝丽魏云林林连兵季秀玲
- 关键词：微生物多不饱和脂肪酸生物合成
- mRNA差异显示技术研究低温条件下深黄被孢霉基因的表达差异被引量：2
- 2015年
- mRNA差异显示技术已经广泛应用于研究植物、动物和微生物在各种环境条件下基因的差异表达研究.研究以15℃和30℃培养的深黄被孢霉M6-22菌体为材料,利用mRNA差异显示技术研究两种培养条件下基因的表达差异.经实时荧光定量PCR验证,共获得7条差异片段,相似性搜索结果表明它们是6-磷酸葡萄糖异构酶、单糖核苷酸转运蛋白、Ras1鸟苷酸转移因子、依赖于NAD的苹果酸脱氢酶、Δ12-脂肪酸脱氢酶、CLK4关联的丝氨酸/精氨酸丰富蛋白和假定蛋白,涉及糖酵解、蛋白质修饰、信号传导、脂肪酸合成和mRNA加工等生命过程,表明深黄被孢霉M6-22低温适应性是多种途径协同调控的结果.
- 杨晓霞何仕武赵汝丽魏云林林连兵季秀玲张琦
- 关键词：深黄被孢霉MRNA差异显示技术荧光定量PCR基因表达差异
- 一个假单胞菌MY1402基因启动子的分离与鉴定
- 2013年
- 利用构建的启动子探针载体pUE,以大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α作为宿主菌,从耐低温假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株MY1402分离基因启动子片段,获得7个具有不同大小的启动子功能片段的重组子,命名为pUE1～pUE7.将其中具有p1片段的重组子PUE1导入假单胞菌MY1402中进行卡那霉素耐受浓度分析,结果显示阳性转化子MY1402/pUE1的最高耐受浓度为250 mg/L,而且在相同抗生素浓度下培养温度从28℃降到15℃并不影响转化子MY1402/pUE1的生长,表明pUE1中的插入片段p1具有低温启动子的活性.将所预测的p1核心序列p1a通过化学合成并连接到探针载体pUE上,构建出重组质粒pUE1a并转化MY4102中进行功能分析.结果显示,28℃条件下p1a片段仍保持相同强度的启动子活性,但15℃条件下活性下降明显,卡那霉素质量浓度高于100 mg/L基本没活性,表明p1a两端序列可能与p1低温转录启动活性有关.
- 冯强张琦林连兵季秀玲魏云林
- 关键词：假单胞菌卡那霉素抗性基因启动子活性
- 一个深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆与表达被引量：2
- 2017年
- 根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumigates)线粒体苹果酸脱氢酶的相似性最高,达71.26%,且含有苹果酸脱氢酶的保守辅酶结合位点、底物结合位点和催化活性位点。将MIMDH2片段连接到表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-MIMDH2,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示在50 k D左右处有一蛋白质条带,酶活分析结果显示经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白酶活高达271.33 U/mg。以上结果说明所克隆的MIMDH2为一个新的潜在的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的活性。
- 崔锦锦季秀玲林连兵魏云林张琦
- 关键词：深黄被孢霉基因克隆原核表达
- 红冬孢酵母Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因的克隆和表达被引量：1
- 2016年
- Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶是多不饱和脂肪酸合成的关键酶.参考已知的Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从红冬孢酵母YM25235中获得了全长为1 341 bp的一个cDNA序列.序列分析表明,该序列具有一个编码446个氨基酸、相对分子质量为50.6 ku的完整开放阅读框,所编码的氨基酸序列与Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶相似性最高但并不相同,而且也具有Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶特异性的3个组氨酸保守区,表明该序列为一个新的编码Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶的基因.为了验证功能,将该基因序列克隆到表达载体pYES3/CT中,构建重组质粒pY3RKD12,并转化到酿酒酵母的缺陷型菌株INVSCI中进行异源表达.通过脂肪酸气相色谱(GC)分析表明,在pY3RKD12转化的酵母细胞总脂肪酸中出现一个保留时间和亚油酸甲酯标准品相同的新峰,其含量占酵母总脂肪酸的3.76%,但在pYES3/CT转化的酵母细胞总脂肪酸中没有检测到.这些结果证明所克隆的序列是一个新的Δ^(12)-脂肪酸脱氢酶基因,其表达的蛋白质可催化油酸合成亚油酸.
- 罗敏周杨晓霞季秀玲林连兵魏云林张琦
- 关键词：亚油酸
- 高山被孢霉Δ^6-脂肪酸脱氢酶基因在红冬孢酵母中的表达被引量：2
- 2014年
- 以绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作为报告基因,将质粒pRH2304转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析,荧光显微观察结果表明GFP在YM25235获得表达,建立了红冬孢酵母YM25235遗传转化方法。在此基础上,以高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因取代pRH2304中的GFP基因,构建重组质粒pRH2304MAD6,将其转化红冬孢酵母YM25235进行表达分析。PCR结果表明,高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已经整合到YM25235基因组中,进一步的脂肪酸气相色谱分析结果表明,该基因编码产物催化n-6途径中的亚油酸转化成γ-亚麻酸,占细胞总脂肪酸的4.35%,但没有检测到催化n-3途径中的α-亚麻酸转化成十八碳四烯酸。
- 李凌彦胡彬彬赵吉然魏云林林连兵季秀玲张琦
- 关键词：高山被孢霉Γ-亚麻酸
- 两个苹果酸酶的表达和酶学性质分析
- 2019年
- 为了探讨深黄被孢霉M6-22中不同苹果酸酶的性质,研究从深黄被孢霉M6-22中克隆得到苹果酸酶MIME1基因并在大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化和酶活分析表明所纯化蛋白能催化苹果酸脱羧生成丙酮酸和NADPH,具有苹果酸酶的特性.同时与前期获得的MIME2进行酶学性质分析.结果显示,重组表达的MIME1和MIME2都具有苹果酸酶的性质,但MIME1的最适温度和最适pH分别为28℃和7.5,MIME2的最适温度和最适pH分别为30℃和5.8,而且在最适温度和最适pH条件下所纯化的MIME1和MIME2酶活分别为292.84U/mg和235.14U/mg.进一步酶学性质分析表明,Mg^2+、Co^2+、Cu^2+、Zn^2+可以提高MIME1的活性,其中Cu2+激活作用最为明显,而EDTA、Ca^2+、Mn^2+对MIME1的活性则有抑制作用;Mn^2+、Mg^2+、Co^2+和Ca^2+对MIME2表现出不同程度的激活作用,其中Mn2+激活作用最为明显,而EDTA、Cu2+和Zn2+则对MIME2的酶活表现出明显的抑制作用.这些分析结果表明,同一种细胞中不同的苹果酸酶具有不同的酶学性质,这可能与它们执行不同的生物学功能有关.通过异源表达和分离纯化,研究初步揭示了2个深黄被孢霉M6-22苹果酸酶的一些酶学性质特点,这为以后深入研究该苹果酸酶结构和功能以及与M6-22菌株油脂积累的关系提供了理论依据和参考.
- 李珊杨晓霞季秀玲林连兵魏云林张琦
- 关键词：深黄被孢霉苹果酸酶基因克隆酶学性质分析
