国家科技支撑计划(2006BAD06A13)
- 作品数：8 被引量：25H指数：2
- 相关作者：王志亮李金明包静月赵德明邹艳丽更多>>
- 相关机构：中国动物卫生与流行病学中心中国农业大学扬州大学更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划青岛市科技发展计划项目国家重点基础研究发展计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学轻工技术与工程更多>>
- 体外转录法制备西尼罗河热病毒RNA片段
- 2011年
- 目的通过体外转录获得西尼罗河热病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计西尼罗河热病毒基因保守区克隆引物,PCR从合成的基因DNA获得相应片段,连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含西尼罗河热病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6ng/μL,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为西尼罗河热病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。
- 邹艳丽赵永刚张永强包静月孙成友王君玮李金明王志亮
- 关键词：T7启动子体外转录
- 热力学因素对绵羊重组朊蛋白体外构象转化的作用
- 2009年
- 构建了绵羊朊蛋白的原核表达载体,获得了高纯度的融合表达蛋白。并在热力学因素的作用下,研究了重组绵羊朊蛋白的构象转化。以基因型为ARQ/ARQ蒙古绵羊的血液DNA为模板,利用DNA重组技术,将绵羊朊蛋白正常成熟蛋白基因OvPrP插入表达载体pET30a,在大肠杆菌BL2l(DE3)中高效表达,获得的表达产物以包涵体形式存在,并对其进行纯化和复性。超滤浓缩后浓度约为0.5 mg/mL的OvPrP97-234,进行热力学处理,利用远紫外线圆二色谱(CD)分析热力学处理前、后蛋白的二级结构的变化,同时,对热力学处理前、后的蛋白进行了蛋白酶K抗性的检测,并对其高级结构进行了预测。结果表明:获得的表达产物经SDS-PAGE分析可见分子量为16kD的蛋白条带,Western-blotting的鉴定证实了所获得的蛋白是特异性的朊蛋白。经Jascow32软件分析,测得天然构象的OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为28.8%、β折叠为0%、转角和无规卷曲为71.1%,无蛋白酶K的抗性。经过热力学处理之后,OvPrP97-234的二级结构含量为:α螺旋为19.3%,β折叠为36.9%,转角和无规卷曲为43.8%,有一定的蛋白酶K抗性。绵羊重组朊蛋白的体外构象转化的分析为朊蛋白的体外构象转化机制和致病机理的研究提供科学依据。
- 王伊琴秦贞奎包勇敢乔俊文赵德明
- 关键词：原核表达圆二色谱
- 心水病病原体高度保守基因合成与原核表达
- 2012年
- 通过软件DNAStar分析,设计合成心水病病原体抗原性、保守性比较高的一段基因,长度为564bp,将它插入pUC57载体,再转入pET-32a质粒中进行原核表达并纯化表达产物。结果表明,合成的基因在大肠杆菌中得到高效表达并能简易地提纯,纯化的表达产物有望用于心水病免疫学检测;此合成外来基因还可以作为心水病病原PCR检测的阳性对照。这些工作为我国建立心水病防控技术储备奠定了一些基础,也为防控高度危险性外来传染病提供一种安全和可行的研究新思路。
- 邹艳丽赵永刚王志亮李玉清张永强包静月王君玮李金明
- 关键词：心水病基因合成
- 绵羊重组朊蛋白特异性抗体的制备
- 2008年
- 余琦周向梅李丽好任伟赵德明
- 关键词：朊蛋白特异性抗体传染性海绵状脑病中枢神经系统绵羊牛海绵样脑病
- 牛朊蛋白和酵母朊毒体结构域融合蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备
- 2012年
- 利用DNA重组技术将酵母Ure2p朊蛋白结构域(UPD)基因插入牛朊蛋白(BPrP)表达质粒pET-PrP中,构建原核表达载体pET-PrP-UPD。阳性质粒转化宿主菌BL21(DE3),在IPTG诱导下获得高效表达。Westernblot检测表明表达的重组蛋白与单克隆抗体6H4呈现特异性反应,且纯化的PrP-UPD融合蛋白在体外具有聚集成淀粉样纤维、抵抗蛋白酶K消化等朊毒体的结构特点。利用纯化的PrP-UPD免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,经克隆和筛选,获得3株稳定分泌抗重组PrP单抗的杂交瘤细胞,分别命名为1G3、3A4、4D1,其中1G3分泌的单抗能识别细胞型牛朊蛋白,其Ig亚类为IgG2b,腹水ELISA效价为1×105,Western blot表明该单抗具有较强的特异性。
- 李炎鑫马贵平杨汉春刘全国史喜菊李冰玲
- 关键词：构象转变单克隆抗体
- 抗朊蛋白单克隆抗体的免疫学特性研究
- 2009年
- 以牛、羊重组朊蛋白(PrP)、正常牛、羊的脑组织匀浆、牛海绵状脑病(BSE)及羊痒病阳性的脑组织匀浆及切片为抗原,测定9株抗朊蛋白单克隆抗体的ELISA、免疫印迹及免疫组化等免疫学反应特性。结果表明:5株单抗可用于BSE及羊痒病的ELISA、免疫印迹检测;3株单抗可用于BSE及羊痒病的免疫组化检测;1株单抗在免疫印迹试验中只与羊痒病PrPSc的核心片段反应,结合该株单抗所识别的抗原表位PrP第78~93氨基酸(aa),证实BSE与羊痒病PrPSc的蛋白酶K消化位点存在差异。
- 吴晓东吴晓东张永强刘雨田邹艳丽刘珊李林
- 关键词：传染性海绵状脑病朊蛋白单克隆抗体免疫学特性
- 内蒙古地方品种绵羊朊蛋白基因多态性分析被引量：3
- 2009年
- 对中国内蒙古的乌珠穆沁羊(46)、苏尼特羊(34)和蒙古羊(22)进行朊蛋白基因的克隆和多态性分析。结果表明,发现了8个朊蛋白基因多态性位点,其中M157I、Q220H、R223K为未见报道的朊蛋白基因多态性位点;痒病中度易感的朊蛋白基因ARQ/ARQ占74.5%,具有痒病抗性朊蛋白基因ARR/ARR占7.9%,未检出对痒病高度易感的朊蛋白基因VRQ/VRQ。从基因水平上推论,乌珠穆沁羊携带的羊痒病抗性的ARR/ARR基因频率较高(15.2%),占ARR/ARR基因型的87.5%,发生羊痒病风险较低。该研究结果在中国活羊的出口贸易和品种选育方面有重要的意义,为出入境动物检疫中羊痒病的风险分析和风险评估提供重要的基础理论资料。
- 王伊琴秦贞奎包勇敢寇福军荆文奎乔俊文赵德明
- 关键词：朊蛋白基因易感性抗性羊痒病
- 西藏阿里地区小反刍兽疫流行病学调查研究被引量：22
- 2008年
- 2007年7月,我国西藏阿里地区首次证实爆发小反刍兽疫疫情,为了认识小反刍兽疫疫情在我国的地理分布、宿主范围等流行状况,我们开展了以血清学和病原学为基础,并结合现场调查的研究。结果表明疫情于2005年冬从边境传到日土县热角村,通过混群、混牧以及引种等方式将疫情进一步扩散,到2007年9月,PPR在阿里地区日土县、改则县、革吉县、札达县均有发生,我国快速采取有效措施,疫情得到控制。
- 陆则基王志亮刘雨田杨楠谢仲伦吴晓东包静月张维李林刘春菊安荣祥索郎次仁达娃次仁白吉平错卓嘎李金明赵文姬任伟杰
- 关键词：小反刍兽疫流行病学宿主
