国家自然科学基金(30170389)
- 作品数：28 被引量：65H指数：4
- 相关作者：徐开林潘秀英杜冰鹿群先李振宇更多>>
- 相关机构：徐州医学院附属医院徐州医学院中国人民解放军空军航空医学研究所附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金江苏省高校自然科学研究项目江苏省“135”工程重点医学人才基金更多>>
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- 携带绿色荧光蛋白基因的逆转录病毒载体的构建及其介导的T细胞基因转移研究被引量：19
- 2005年
- 为了构建含绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的逆转录病毒载体和研究逆转录病毒对T细胞的感染能力,利用亚克隆技术将磷酸甘油酸激酶启动子(phosphoglyceratekinasepromoter,PGK)基因和GFP全长cDNA插入逆转录病毒载体pLXSN,采用磷酸钙沉淀法将重组载体转染PA317包装细胞,G418筛选出抗性克隆,收集滴度最高的病毒上清感染NIH3T3和T细胞,在倒置荧光显微镜下观察GFP表达情况。结果表明;重组逆转录病毒载体转染PA317包装细胞后,可在荧光显微镜下观察到GFP的表达。G418筛选后,含GFP的逆转录病毒可感染原代培养的T细胞。结论:逆转录病毒载体能够快速、稳定地将外源基因转移至T细胞,可作为介导T细胞基因转移的重要工具。
- 陈香梅徐开林潘秀英李振宇鹿群先李德鹏
- 关键词：逆转录病毒载体绿色荧光蛋白基因T细胞基因转移
- 延迟连续移植预防小鼠移植物抗宿主病的实验研究被引量：1
- 2007年
- 目的研究延迟连续移植对小鼠异基因移植后急性移植物抗宿主病（aGVHD）的影响。方法近交系BALB/c（H-2d）受鼠接受8.0 Gy全身放疗（TBI）后,分4组（每组n=20）输注供鼠C57BL/6（H-2b）骨髓和脾细胞的混合液：①经典移植组（TBI后4 h输注）;②连续移植组（TBI后4 h、1-3天连续输注）;③延迟移植组（TBI后4天输注）;④延迟连续移植组（TBI后4-7天连续输注）。流式细胞仪检测移植后各组T细胞亚群、NK细胞、H-2b的表达,比较各组受鼠生存率、aGVHD情况及造血重建。结果经典移植组均于3周内死于aGVHD,连续移植组、延迟移植组60天生存率分别是30%、50%。延迟连续移植组60天生存率为70%,高于其他3组（P＜0.05）。延迟连续移植组20天时外周血白细胞计数恢复正常,30天时T细胞亚群和NK细胞的表达恢复正常,60天时H-2b细胞的百分率为98.13%±1.11%。结论延迟连续骨髓移植可减轻小鼠异基因移植后的aGVHD,提高生存率,同时不影响骨髓植入、造血和免疫重建,是一种简单有效的预防aGVHD的新方法。
- 王春玲徐开林潘秀英杜冰
- 关键词：骨髓移植移植物抗宿主病
- rhG-CSF和rhGM-CSF动员小鼠外周血干细胞效果的比较研究被引量：1
- 2007年
- 目的比较重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)和重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)单独、同时或序贯联合应用对小鼠外周血干细胞(PBSC)的动员作用,从而选择最佳的动员方案。方法72只BALB/c小鼠随机分成6组,每组12只。A组皮下注射rhG-CSF 400μg.kg-1.d-1;B组皮下注射rhGM-CSF 400μg.kg-1.d-1;C组皮下注射rhG-CSF 200μg.kg-1.d-1+rhGM-CSF 200μg.kg-1.d-1;D组皮下注射rhGM-CSF 400μg.kg-1.d-1(前3天)+rhG-CSF 400μg.kg-1.d-1(后2天);E组皮下注射rhG-CSF 400μg.kg-1.d-1(前3天)+rhGM-CSF 400μg.kg-1.d-1(后2天),连续注射5天。对照组连续5天皮下注射生理盐水0.2 ml。动态观察各组外周血白细胞计数、CD34+细胞比例、CFU-GM产率的变化。结果rhG-CSF与rhGM-CSF单独或联合使用时,外周血白细胞计数、CD34+细胞、CD34+CD38-细胞和粒-单核细胞集落形成单位(CFU-GM)产率明显高于对照组(P<0.01)。实验组中,含有rhG-CSF组的外周血白细胞计数、CD34+细胞产率明显高于单用rhGM-CSF组(P<0.01);含有rhGM-CSF组的CD34+CD38-细胞产率明显高于单用rhG-CSF组(P<0.01);rhG-CSF与rhGM-CSF联合组CFU-GM产率高于单用rhG-CSF、rhGM-CSF组(P<0.05)。结论rhG-CSF联合rhGM-CSF方案可作为外周血干细胞动员的一个较好的选择。
- 高立艳徐开林潘秀英
- 关键词：外周血干细胞动员粒-巨噬细胞集落刺激因子CD34+细胞
- 昆明山海棠提取物预防急性移植物抗宿主病的实验研究被引量：1
- 2010年
- 目的观察昆明山海棠(THH)提取物在急性移植物抗宿主病(aGVHD)中的作用及其可能的作用机制。方法建立aGVHD模型,BALB/c受鼠清髓性预处理后分别用生理盐水、环孢素A(CsA)、THH及CsA+THH混合物灌胃。观察移植后受鼠aGVHD、生存时间、CD4+/CD8+比率、CD4+CD25+T细胞比率及脾细胞Foxp3 mRNA水平。结果生理盐水组出现典型aGVHD,20天内全部死亡。其余3组aGVHD临床、病理表现及生存时间均改善,组间无差异;CD4+/CD8+比率、受鼠CD4+CD25+T细胞比率及脾Foxp3 mRNA表达较生理盐水组升高,以联用组明显。结论THH可减轻小鼠aGVHD,延长其生存时间。机制可能与增加CD4+CD25+T细胞比率,上调Foxp3 mRNA表达,调节CD4+/CD8+比率有关。THH和小剂量CsA联合有协同作用。
- 王春晴李振宇徐开林
- 关键词：昆明山海棠移植物抗宿主病CD4+CD25+T细胞FOXP3
- 逆转录病毒与慢病毒介导HSV-TK/GCV防治移植物抗宿主病的比较研究
- 2007年
- 移植物抗宿主病（GVHD）是限制异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的最主要并发症，现有的防治方法均不理想，应用自杀基因系统防治GVHD是一个新的尝试。本实验将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的逆转录病毒和慢病毒分别感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植到经Co^60γ射线照射后的受鼠（BABL/C小鼠），移植后分别给受鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV），初步观察HSV-TK／GCV系统控制GVHD的效果，并在体内外实验中对两种载体进行比较研究。
- 杜冰徐开林朱锋高飞陈香梅潘秀英
- 关键词：移植物抗宿主病TK/GCV慢病毒介导逆转录病毒C57BL/6小鼠
- B7-1与GM-CSF双顺反子慢病毒转染骨髓基质细胞的研究
- 2008年
- 目的研究B7-1和粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)双基因共表达慢病毒载体是否可介导目的基因在人骨髓基质细胞(MSCs)有效表达。方法采用改良的磷酸钙沉淀法将包装质粒、包膜蛋白质粒和含目的基因的转移质粒共转染293T包装细胞,收集的病毒上清感染密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养的MSCs,用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)分析转导细胞绿色荧光蛋白(GFP)表达,RT-PCR分析目的基因在转导细胞的表达。结果密度梯度离心法结合贴壁筛选法分离培养第三代的MSCs,CD90表达阳性率达到93.62%,包装好的慢病毒颗粒可成功感染293T包装细胞和MSCs,用荧光显微镜和FCM均可检测到转染细胞中GFP表达,阳性率分别为77.66%和43.97%,RT-PCR方法可扩增出转染细胞表达B7-1和GM-CSF基因片段。结论B7-1和GM-CSF双基因共表达慢病毒载体可高效转移目的基因至骨髓基质细胞并获得有效表达。
- 杜冰徐开林鹿群先程海闫冬梅潘秀英
- 关键词：B7-1粒-巨噬细胞集落刺激因子慢病毒
- HSV1-TK、HSV1-SR39TK及GCV、ACV对小鼠T淋巴细胞的杀伤作用研究
- 2007年
- 目的观察慢病毒载体携带的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-TK)和突变型单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(HSV1-SR39TK)基因在小鼠T淋巴细胞的表达及前体药物丙氧鸟苷(GCV)、无环鸟苷(ACV)对小鼠T淋巴细胞的杀伤效应。方法用亚克隆技术将PCR扩增的HSV1-TK、HSV1-SR39TK基因分别连接至慢病毒载体,在TK、SR39TK基因后以内部核糖体进入位点(IRES)连接绿色荧光蛋白(GFP)基因,采用三质粒包装系统包装病毒,将病毒感染刀豆蛋白A激活的小鼠T淋巴细胞,然后通过CCK-8方法观察其对前体药物GCV、ACV的敏感性。结果慢病毒载体携带的HSV1-TK及HSV1-SR39TK基因均可在小鼠T淋巴细胞内高效表达,GCV和ACV对转导TK基因的淋巴细胞均有杀伤作用,含突变型TK基因的淋巴细胞对前体药物敏感性更高,后者对GCV的IC_(50)值比野生型小2.5倍,对ACV的IC_(50)值比野生型小17.4倍。结论表达HSV1-SR39TK基因的T细胞对GCV有更高的敏感性,对ACV也较敏感,应用HSV1-SR39TK基因进行防治GVHD的研究是更好的选择。
- 高飞徐开林潘秀英鹿群先杜冰
- 关键词：移植物抗宿主病HSV1-TKIRES
- 全文增补中
- Ⅱ类抗原反式激活因子与HLA-DR抗原的关系及其意义(英文)被引量：7
- 2007年
- 本研究探讨Ⅱ类抗原反式激活因子(CIITA)和人类白细胞抗原(HLA-DR)表达时相的关系和差异,及STAT1-α反义寡核苷酸(STAT1-αAS)对CIITA和HLA-DR的抑制作用。分离健康志愿者外周血T淋巴细胞,给予不同剂量干扰素-γ(IFN-γ)后,用RT-PCR法检测CIITAmRNA,Westernblot分析HLA-DR抗原表达,然后给予不同浓度STAT1-αAS和STAT1-α寡核苷酸有义链(STAT1-αS),再次检测CIITAmRNA和HLA-DR的表达。结果表明:CIITAmRNA在IFN-γ作用后5小时开始表达,14小时达峰值;HLA-DR在28小时后可被检测出,52小时达高峰。5、10和20μmol/LSTAT1-αAS作用于细胞后,CIITAmRNA的表达显著低于对照组(P<0.01),而在S组明显高于AS处理组(P<0.01),S组与对照组间无显著差异;HLA-DR的表达可被STAT1-αAS抑制,AS组仅为对照组的64.3%(P<0.01),S组与对照组间仍无差异;STAT1-αAS作用后,HLA-DR变化同CIITA。结论:CIITAmRNA表达与HLA-DR表达呈正相关且早于后者;STAT1-αAS可特异性抑制CIITA和HLA-DR的表达,并能预防T淋巴细胞激活,CIITA在移植免疫病因中起重要作用。
- 徐开林李慧潘秀英李振宇鹿群先张颖主鸿鹄杜冰曾令宇
- 关键词：HLA-DR反义寡核苷酸干扰素-Γ
- 小干扰RNA特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD28基因表达的研究被引量：4
- 2005年
- 目的 :为了探讨体外转录法合成的小干扰RNA(smallinterferingRNA ,siRNA)对人淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因表达和功能的影响。方法 :设计并合成 3条siRNA(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3) ,在阳离子脂质体的介导下转染淋巴细胞。于转染后 2 4、4 8、72小时收集细胞 ,用半定量RT PCR方法检测CD2 8mRNA的变化 ;流式细胞仪检测CD2 8表达的变化。结果 :体外合成的 3条siRNA通过脂质体转染淋巴细胞后 ,均能不同程度地抑制共刺激分子CD2 8的表达。转染后 4 8小时的流式细胞仪检测显示siRNA 1、siRNA 2和siRNA 3组的CD2 8表达抑制率分别为 2 2 10 %± 1 6 3%、73 5 0 %± 1 0 2 %和 4 2 90 %± 0 89% ,以siRNA 2的CD2 8抑制作用最强。半定量RT PCR检测显示siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3转染后淋巴细胞的CD2 8mRNA均受到不同程度的抑制 ,其中siRNA 2组的抑制作用最明显 (74 10 %± 1 6 5 % )。结论 :siRNA可特异性抑制淋巴细胞共刺激分子CD2 8基因的转录和表达 ,从而为进一步研究siRNA在移植免疫耐受及防治GVHD方面的应用提供了理论和实验基础。
- 张颖徐开林潘秀英鹿群先
- 关键词：RNA干扰小干扰RNA淋巴细胞
- Ⅱ类抗原反式激活因子和人白细胞抗原-DR检测方法的比较被引量：2
- 2003年
- 目的 研究Ⅱ类抗原反式激活因子 (CⅡTA)与人白细胞抗原 DR(HLA DR)表达的相关性 ,探讨CⅡTA在移植物抗宿主病 (GVHD)中检测的意义。方法 从健康人外周血分离获得T细胞 ,给予干扰素 γ(IFN γ) 10 0 0U /ml后 ,在不同时间用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR )检测CⅡTAmRNA表达 ,用免疫印迹法检测HLA DR抗原的表达。然后 ,给予Stat1α反义寡核苷酸 (AS)抑制CⅡTA ,分别检测CⅡTAmRNA及HLA DR抗原在各自表达量最高时间点的变化。结果 CⅡTAmRNA在IFN γ作用后 5h开始表达 ,至 14h表达量最高 ,此后逐渐下降 ;HLA DR抗原在 2 8h可检测出 ,52h表达量最高 ,此后逐渐下降 ,至 76h仅可检测到少量抗原的表达 ;给予AS后与对照组相比 ,CⅡTAmRNA和HLA DR表达量均下降。结论 CⅡTA与HLA DR表达成正相关性 ,且先于HLA DR出现 。
- 李慧徐开林潘秀英李振宇鹿群先
- 关键词：人白细胞抗原-DR移植物抗宿主病逆转录聚合酶链反应
