重庆市教委科研基金(KJ100313)
- 作品数：4 被引量：6H指数：2
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- 测定谷胱甘肽-S-转硫酶动力学参数的变化表征其抑制剂被引量：3
- 2011年
- 目的:测定谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferases,GST)动力学参数变化,建立表征其抑制剂的方法。方法:从猪肝经阴离子交换层析和亲和层析制备GST酸性同工酶,用还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和1-氯-2,4-二硝基苯(1,-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)合成S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)为候选抑制剂,以GSH与CDNB为底物测定GST在GS-DNB作用下的米氏常数(Km)和最大反应速度(Vm),从而确定GS-DNB对GST的抑制常数(Ki)。结果:此GST被纯化146倍以上,活性总收率近30%。该GST对GSH和CDNB的Km分别为42μmol/L和0.86 mmol/L,属于随机双底物动力学模型。GS-DNB对CDNB竞争性Ki为(21±1)μmol/L(n=2);对GSH竞争性Ki为(17±1)μmol/L(n=2)。结论:产物GS-DNB是GST的高亲和力竞争性抑制剂;测定GST动力学参数随抑制剂浓度的变化可筛选其抑制剂。
- 张灵杨晓兰白婧廖娟刘红博廖飞
- 关键词：谷胱甘肽-S-转移酶抑制剂还原型谷胱甘肽
- 融合标签谷胱甘肽S-转硫酶高亲和配体的设计与筛选被引量：3
- 2012年
- 目的:设计与筛选融合标签血吸虫谷胱甘肽S-转硫酶(Glutathione S-transferase,GST)的高亲和配体。方法:将原核融合表达载体pGST-MOLUC转入大肠杆菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷低温诱导GST标签表达,用Glutathione Sepharose 4B亲和纯化此标签GST。初速度法测定GST对底物1-氯-2,4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)的Km;测定GST产物S-(2,4-二硝基苯基)-谷胱甘肽(GS-DNB)、3,5-二甲基苯甲酸、对丁基苯甲酸、依他尼酸及3者对应的对称双酰丁二胺对标签GST的抑制作用。结果:纯化标签GST对GSH和CDNB顺序结合且Km都高于0.10mmol/L;GS-DNB相对CDNB的竞争性抑制常数约5μmol/L,相对GSH的非竞争性抑制常数约33μmol/L。3,5-二甲基苯甲酸、对丁基苯甲酸、依他尼酸对此GST抑制常数都大于0.20 mmol/L;N,N’-双依他尼酰-1,4-丁二胺和N,N’-双对丁基苯甲酰-1,4-丁二胺都为GST相对GSH的强竞争性抑制,抑制常数分别为31 nmol/L和(0.61±0.43)μmol/L(n=3)。结论:将标签GST低亲和力芳香羧酸用柔性短链连成对称结构,可获得结合于单个活性中心的高亲和力标签GST抑制剂。
- 杨宪峰张灵杨晓兰龙高波张奕廖飞
- 关键词：抑制剂配体
- 2种聚乙二醇不饱和酸单酯共聚合包被Fe_3O_4制备磁性微球及其表征被引量：1
- 2012年
- 目的:用两种聚乙二醇(Polyethylene glycol,PEG)不饱和酸单酯经自由基共聚包被纳米Fe3O4磁芯制备磁性微球,考察其功能化后特异性和非特异性结合作用。方法:水解沉淀法制备纳米Fe3O4磁芯;用PEG-350单甲醚丙烯酸酯和PEG-1540单顺丁烯酸单酯为单体,在正庚烷-水组成的油包水体系自由基共聚制备磁性微球;将微球表面来自PEG-1540的羟基经甲磺酸酯活化、连接乙二胺后再用活化生物素修饰。透射电镜观察其外貌;测定与碱性磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin labeled byalkaline phosphate,AP-SAV)的特异性结合、与4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯等的非特异性结合。结果:所得Fe3O4粒径60 nm左右,生物素修饰后粒径接近200 nm。此磁性微球可从混合蛋白中选择性分离碱性磷酸酶酶标记的链亲和素,结合容量约51 ng蛋白/g磁性微球;4-硝基-1-萘酚苯甲酸酯在浓度很低时同此磁性微球的结合低于检测限,在浓度高达64μmol/L时仍无显著结合。结论:用两种PEG不饱和酸酯共聚包被Fe3O4可制备表面亲水磁性微球,功能化后有特异相互作用且非特异性作用很弱,但还需提高此磁性微球功能化后的特异性结合容量。
- 刘冬龙高波杨晓兰蒲军赵华廖娟廖飞
- 关键词：磁性微球自由基共聚合
- 用4-硝基-1-萘磷酸酯为底物测定碱性磷酸酶活性
- 2013年
- 目的：合成4-硝基-1-萘磷酸酯（4-nitro-1-naphthyl phosphate,NNPP）为显色底物测定牛小肠黏膜碱性磷酸酶（alka-line phosphatase,ALP）。方法：4-硝基-1-萘酚（4-nitronaphthol,4-NNP）与三氯氧磷反应,经硅胶柱纯化制得NNPP;检测产物吸收跟踪水解过程测定初速度,双倒数法测定米氏常数（Michaelis-Menten constant,Km）。结果：ALP水解NNPP产物最大差吸收峰接近460 nm,等吸收波长接近405 nm。与p-硝基苯酚相比,在pH 6.0~7.0间4-NNP消光系数为其3倍以上,在pH 7.0以上为其2倍以上。ALP对NNPP的Km约12μmol/L而p-硝基苯基磷酸酯的Km约35μmol/L,产物磷酸相对NNPP的竞争性抑制常数接近20μmol/L。ALP催化NNPP水解效率接近水解p-硝基苯基磷酸酯的40%。结论：NNPP可用于测定ALP活性,且有望与作用于p-硝基苯酚类显色底物的其它酶联用实现单通道两种酶同步测定。
- 党济政刘红博杨宪锋杨晓兰龙高波李元丽蒲军廖飞
- 关键词：碱性磷酸酶
