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产克拉维酸的棒状链霉菌突变株的选育被引量：9: 2007年; 以棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus),B71为出发菌株,通过紫外线诱变育种,采用琼脂块法初筛和摇瓶发酵复筛,选育出2株甘油耐受性正向突变株S.clavuligerus B71—14和S.clavuligerus B71-49,在摇瓶条件下,其克拉维酸产量与出发菌株S.davuligerus B71相比,分别提高了90.6%和88.8%,并具有良好的遗传稳定性。; 王艳萍张永生张阳左志晗; 关键词：棒状链霉菌紫外诱变克拉维酸

PCR-寻靶体系构建棒状链霉菌lat基因插入突变的重组质粒pELA: 2007年; 本实验将PCR所得的1.8kb的lat基因片段插入到pUCm-T载体的多克隆位点,得到重组质粒pUCm-T-lat,经EcoRI-HindⅢ双酶切后得到lat基因片段,与经同样双酶切的穿梭质粒pGH112进行连接,得到重组质粒pGH112-lat。将其电转至大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat。同时,根据棒状链霉菌lat基因的序列及质粒pIJ77(3 pIJ773为可提供阿泊拉抗性的模板质粒)中阿泊拉抗性基因(aac(3)iv)的序列设计一对长59nt及58nt的引物,两引物分别含有20nt及19nt的阿泊拉抗性基因的互补序列和39nt的lat基因两端的互补序列,以质粒pIJ773为模板,PCR扩增得到的产物为两端带有lat基因上下游同源序列的阿泊拉抗性基因,将此PCR产物称为阿泊拉抗性框,将此阿泊拉抗性框电转至E.coli BW25113/pIJ790/pGH112-lat转化子中。在质粒pIJ790的作用下,阿泊拉抗性框中两端的lat基因同源序列与pGH112-lat中的野生型lat基因发生同源双交换,使得阿泊拉抗性框插入lat基因中,得到lat基因中插入阿泊拉抗性基因(lat::apr)的重组质粒pELA。该质粒的构建为进一步构建棒状链霉菌lat基因插入阻断的突变株,从而实现克拉维酸产量的提高奠定了初步基础。; 左志晗王艳萍; 关键词：棒状链霉菌克拉维酸 LAT 重组质粒

β-内酰胺酶抑制剂棒酸研究进展: ＜正＞大量体外抗菌作用研究表明β-内酰胺酶抑制剂与β-内酰胺类抗生素联合应用后可增强后者的抗菌活性体外抑菌活性。由于克拉维酸对β-内酰胺酶有良好的抑制作用和理想的药代动力学特性,促使研究与青霉素的复方制剂。目前克拉维酸...; 王艳萍左志晗; 文献传递

增加ccaR基因剂量提高棒状链霉菌克拉维酸产量的研究被引量：3: 2008年; CcaR蛋白对棒状链霉菌(S.clavuligerus)中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码。PCR获得包含ccaR完整基因及其上下游一定区域的扩增产物,构建重组质粒pSET152-ccaR并转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002后,通过属间接合转移至棒状链霉菌B71-14中。pSET152含有attP位点,可以与链霉菌基因组中的attB位点特异性同源整合,将重组质粒pSET152-ccaR携带的ccaR插入到S.clavuligerusB71-14染色体中的attB位点,实现了在S.clavuligerusB71-14基因组中增加一个拷贝ccaR基因的目的,所得的突变株S.clavuligerusB71-14:ccaR产酸量可达821.92 mg/L,是出发菌株的1.54倍。; 白小佳左志晗王艳萍; 关键词：棒状链霉菌克拉维酸

棒状链霉菌中lat基因的突变及其对克拉维酸产量的影响被引量：4: 2007年; 以棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus NRRL3585的染色体为模板扩增得到1条1.77kb的lat基因片段,并将其用于构建重组质粒pKCLES。将pKCLES由E.coli ET12567接合转移至S.clavuligerus中。重组质粒pKCLES与S.clavuligerus染色体中野生型lat基因发生同源交换,从而获得了带有阿泊拉抗性的突变菌株。对S.clavuligerus NRRL3585以及lat突变菌株的基因组进行PCR验证,且测定了这2种菌株的产头酶素C的能力。结果均表明,突变菌株中的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的pKC1139片段而遭到了破坏。另外,以HPLC法测定了这2种菌株在不同培养时间(72h和96h)下的克拉维酸的产量,结果显示,lat突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的2.3倍。; 王艳萍崔艳艳左志晗郭金体张阳; 关键词：棒状链霉菌克拉维酸基因突变

lat基因的失活在提高棒状链霉菌棒酸产量中的应用被引量：3: 2007年; 利用lat基因突变的重组质粒pKCLHS对紫外诱变的克拉维酸(Clavulanic acid)高产菌株Streptomyces clavuligerusB71-14的lat基因进行了插入失活,对获得的基因突变子进行了PCR验证、菌体生长测定、发酵特征测定,并对发酵液中的克拉维酸进行了初步提取和含量测定.结果表明,突变菌株的lat基因中插入了含有阿泊拉抗性的基因片段,突变菌株的生长速度与原始菌株无明显变化l,at突变菌株的克拉维酸产量最高能达到其原始菌株的1.11～1.29倍,产头霉素C的能力显著降低.; 左志晗张阳郭金体王艳萍; 关键词：棒状链霉菌克拉维酸基因突变

发酵液中克拉维酸含量的测定方法被引量：4: 2005年; 介绍了3种测定克拉维酸含量的方法,即高效液相色谱法、紫外分光光度法与生物效价法,3种方法测定结果进行分析研究,得出三种方法之间具有较好的相关性。高效液相色谱法及紫外分光光度法均基于克拉维酸与咪唑反应衍生后的衍生物在312nm处有特征吸收,且衍生后的色谱图在反相高效液相色谱柱上可有效避免发酵液中其他组分的干扰;生物效价法采用KlebsiellapneumoniaeATCC29665作为指示菌。由于3种方法测定结果之间具有相关性,可以根据不同的实验条件及实验目的选用不同的检测方法。; 王艳萍左志晗张建韩英素; 关键词：发酵液 PNEUMONIAE 高效液相色谱柱生物效价克拉维酸指示菌

无机盐MgCl_2和微量金属离子Zn^(2+)对克拉维酸产量的影响被引量：1: 2008年; 对本实验室UV诱变获得的棒状链霉菌Streptomyces clavuligerus B71-14在优化培养基配方的基础上,考察不同微量金属离子对克拉维酸发酵产量的影响,确定Zn2+对其发酵产量有比较明显的促进作用.进一步考察不同添加浓度MgCl2和Zn2+对克拉维酸合成趋势的影响,确定在本实验发酵培养基中MgCl2和Zn2+的最佳添加量分别为1.5,g/L和00.5,g/L最佳添加浓度,并在最适添加浓度下考察其对发酵代谢过程参数的影响,其最高产量与不添加相比分别提高了457.6%和631.0%.; 王艳萍郭金体张阳左志晗; 关键词：棒状链霉菌克拉维酸 MGCL2 ZN^2+

应用原生质体融合技术选育克拉维酸高产菌株: 2008年; 采用棒状链霉菌种内原生质体融合技术,选育克拉维酸高产菌株.该实验选用舒巴坦钠耐受性高产菌株Streptomyces clavuligerus B71-3-10和甘油耐受性高产菌株Streptomyces clavuligerus B71-14为亲株,优化了原生质体制备条件和融合条件,最终得到遗传稳定性良好的融合子F14.该融合子的克拉维酸产量提高到650.35 mg/L,分别比亲株S.clavuligerus B71-3-10和S.clavuligerus B17-14的克拉维酸产量高36.77%和20.84%.将原生质体融合技术应用到棒状链霉菌克拉维酸高产菌株的选育中,证明了其可行性、高效性及成效显著性.; 张阳张恺郭金体王艳萍; 关键词：棒状链霉菌原生质体融合

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天津市自然科学基金(043802711)