广东省医学科学技术研究基金(A2013244)
- 作品数：5 被引量：5H指数：2
- 相关作者：李书华张雅洁陈艺瑛李灏陈婷婷更多>>
- 相关机构：广州医科大学更多>>
- 发文基金：广东省医学科学技术研究基金广州市教育系统创新学术团队项目广州市科技计划项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 重组腺病毒载体pDC316-hIL--24的构建及病毒滴度测定被引量：2
- 2014年
- 目的构建重组腺病毒载体pDC316-hIL-24,并测定病毒滴度。方法从HEK293细胞中提取mRNA,设计特异性引物,通过RT-PCR法扩增hIL-24基因全编码区序列。将测序正确的片段用BglⅡ和HindⅢ双酶切定向插入到pDC316-EGFP穿梭质粒中。构建重组穿梭质粒pDC316-EGFP-hIL-24,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC316-hIL-24,经HEK293细胞扩增,TCID50法测定重组腺病毒滴度。结果成功构建出表达h IL-24基因的重组腺病毒载体(pDC316-hIL-24),获得了高滴度表达hIL-24基因的重组腺病毒。结论重组腺病毒表达载体(pDC315-hIL-24)的成功构建及重组腺病毒的获得有利于进一步开展肿瘤的转基因治疗研究。
- 李书华陈婷婷刘谕昆李灏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：重组腺病毒载体病毒滴度
- MDA-7基因的腺病毒载体构建及对肺腺癌A549细胞凋亡的影响被引量：3
- 2014年
- 目的构建一种由腺病毒AdMax包装系统表达目的基因——黑色素瘤分化相关基因-7(MDA-7)的复制缺陷型腺病毒,并初步探索其抗肿瘤活性。方法通过基因操作技术将目的基因(MDA-7)插入到5型腺病毒AdMax包装系统的E1A区域,构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP;同时构建对照病毒Ad.EGFP。病毒滴度计算按寇化法(Karber法)进行腺病毒感染性滴度(TCID50)测定。应用免疫组化染色法检测MDA-7在感染2种病毒的肺腺癌A549细胞中的表达状态;通过二苯甲亚胺-碘化丙啶(Hoechst33342-PI)双染色法及流式细胞仪检测2种病毒对肿瘤细胞杀伤的差异。结果成功构建携带目的基因的腺病毒载体,经聚合酶链反应(PCR)鉴定正确;MDA-7在感染Ad.hMDA-7-EGFP的肺腺癌A549细胞中表达,以相同感染复数(MOI)值感染Ad.EGFP时肺腺癌A549细胞中未检测到MDA-7表达;Ad.hMDA-7-EGFP对肿瘤细胞株杀伤能力明显高于Ad.EGFP。结论成功构建复制缺陷型腺病毒Ad.hMDA-7-EGFP,并证实MDA-7蛋白在肿瘤细胞中过表达,诱导肺腺癌A549细胞株发生凋亡。
- 李书华龙捷王红艳谢晓斌张雅洁
- 关键词：病毒复制基因疗法复制缺陷型腺病毒
- 可活化细胞穿膜肽-聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺-Ad.mda-7.egfp接合物的合成及跨膜运输途径检测
- 2015年
- 目的：合成一种由可活化细胞穿膜肽（ACPP）、水溶性高分子聚合物聚N-（2-羟丙基）甲基丙烯酰胺（pHPMA）修饰腺病毒的接合物，并初步探索该接合物的跨膜运输途径。方法通过化学合成的方法合成ACPP。将肺腺癌细胞株A549、乳腺癌细胞株MDA-MB-231、肺支气管上皮细胞株HBE和肝癌细胞株HepG2均分为两组，分别加入培养基及终浓度为10 mg/L基质金属蛋白酶抑制剂强力霉素，12 h后加入ACPP，通过荧光显微镜观察并鉴定ACPP对各细胞的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad. mda-7.egfp及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp，通过荧光显微镜观察并初步鉴定接合物的合成和对A549细胞的穿膜活性。应用流氏细胞术检测接合物感染A549细胞的能力。通过荧光显微镜观察并鉴定接合物ACPP-pc-Ad. mda-7. Egfp在A549细胞内定位及穿膜活性。结果合成了ACPP 100 mg。ACPP对A549、MDA-MB-231、HepG2细胞株具有靶向性穿膜活性，而HBE细胞内未见绿色荧光，强力霉素组细胞经过强力霉素作用后与ACPP-FITC孵育，4种细胞内均未见明显绿色荧光反应，强力霉素阻断了ACPP的肿瘤选择性穿膜作用。合成了两种接合物pc-Ad.mda-7.egfp（粒径420.6 nm）及ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp（粒径462.2 nm）。将ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、pc-Ad.mda-7.egfp接合物、Ad.mda-7.egfp与A549细胞共培养后，可见空白对照组（培养基）无绿色荧光蛋白表达，pc-Ad.mda-7.egfp接合物仅见微量绿色荧光蛋白表达，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp、Ad.mda-7.egfp组所有细胞均可见强烈绿色荧光蛋白表达。经流氏细胞仪检测，ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp组A549细胞PI荧光值明显高于pc-Ad.mda-7. egfp组。经荧光显微镜观察证实接合物ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp大量分布于A549细胞胞质，而pc-Ad. mda-7.egfp仅出现少量内吞性囊泡。结论成功合成了ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp接合物，并证实ACPP-pc-Ad.mda-7.egfp以非内吞途径进行跨膜运输。
- 李书华许泽鹏陈艺瑛陈婷婷刘谕昆李灏马少丹张雅洁
- 关键词：蛋白质转运
- 可活化细胞穿膜肽的设计及修饰高分子载体pHPMA的作用检测
- 2014年
- 目的合成一种可活化细胞穿膜肽ACPP,并初步探索其穿膜活性及其对高分子聚合物pHPMA的共价修饰作用。方法通过化学合成的方法合成可活化细胞穿膜肽ACPP,通过免疫荧光法检测细胞内mmp2蛋白的表达;通过荧光显微镜观察鉴定ACPP的穿膜活性。通过化学修饰法合成接合物pc-Ad.egfp及ACPP-pc-Ad.egfp。通过荧光显微镜观察及动态光散射法初步鉴定接合物的合成,通过荧光显微镜观察鉴定接合物ACPP-pc-Ad.egfp亚细胞分布。结果成功合成了可活化细胞穿膜肽ACPP;ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性;通过ACPP修饰高分子聚合物pHPMA合成了ACPP-pc-Ad.egfp;经荧光显微镜观察证实ACPP-pc-Ad.egfp具有较强的感染细胞的能力,并由ACPP介导大分子进行非内吞性跨膜运输。结论成功合成了ACPP,ACPP具有肿瘤靶向性穿膜活性,并成功修饰高分子聚合物pHPMA。
- 李书华罗颖洁王俊蔡君香许泽鹏陈艺瑛张雅洁
- 关键词：肿瘤靶向共价修饰
- ACPP-pHPMA-Ad.egfp接合物的合成及其逃逸腺病毒中和抗体的作用检测
- 2014年
- 目的:合成一种由可活化细胞穿膜肽ACPP、水溶性高分子聚合物pHPMA修饰腺病毒的接合物,并初步探索该接合物逃逸腺病毒中和抗体免疫清除的能力。方法:通过化学合成的方法合成高分子聚合物pHPMA及可活化细胞穿膜肽ACPP,通过化学合成的方法合成了接合物ACPP-pc-Ad.egfp。通过动态光散射检测高分子聚合物ACPP-pc-Ad.egfp的粒径,通过酶标仪检测接合物ACPP-pc-Ad.egfp感染能力,通过酶标仪检测接合物ACPP-pc-Ad.egfp感染能力免疫逃逸能力。结果:成功合成了高分子聚合物pHPMA及可活化细胞穿膜肽ACPP;动态光散射检测结果表明ACPP及pHPMA修饰的腺病毒接合物粒径增大;酶标仪检测接合物ACPP-pc-Ad.egfp具有较强的感染A549细胞的能力,并对腺病毒中和抗体的免疫清除发生了明显的免疫逃逸。结论:成功合成了ACPP-pc-Ad.egfp接合物,并证实ACPP-pc-Ad.egfp能对机体的腺病毒免疫清除发生免疫逃逸。
- 李书华陈婷婷刘谕昆李灏陈贤亮张雅洁
- 关键词：EGFP免疫逃逸
